[發明專利]一種用于禽源多殺性巴氏桿菌及其血清型鑒定的多重PCR引物

在審

• 申請號: 202110200114.0
• 申請日: 2021-02-23
• 公開（公告）號: CN112760394A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 陳紅梅;黃瑜;程龍飛;傅光華;施少華;萬春和;傅秋玲;劉榮昌
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明提供了一種用于禽源多殺性巴氏桿菌及其血清型鑒定的多重PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1?6所示。本發明根據NCBI(National Center for Biotechnology Information）數據庫禽源多殺性巴氏桿菌中kmt1基因（Genbank:AF16259）、編碼莢膜A型（capA）(Genbank:AF067175)和編碼脂多糖（LPS1）基因簇等的保守序列進行引物設計，于國內外率先建立禽源多殺性巴氏桿菌及其血清型（A型和L1型）鑒定的多重PCR引物，該方法靈敏度高、特異性強，最低可檢測116pg的核酸。

技術領域

本發明涉及一種用于禽源多殺性巴氏桿菌及其血清型鑒定的多重PCR引物，屬于獸醫傳染病學領域。

背景技術

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，P. multicida ）屬于革蘭氏陰性桿菌，是一類重要的、能感染多種宿主的病原菌，可導致禽霍亂，豬萎縮性鼻炎，還可以導致牛、羊以及家兔等動物發生出血性敗血病。該類細菌流行于全球，給各地的養殖業造成了不可估量的經濟損失。禽源多殺性巴氏桿菌可感染各品種水禽，30日齡以上特別是產蛋水禽更易感。急性發作時病程短促，死亡率高，病變特征為心冠脂肪出血、肝臟灰白色點狀壞死和腸道出血等。慢性發作時，以慢性呼吸道炎、慢性胃腸炎、肉髯水腫和關節炎等多見。禽霍亂已成為危害水禽養殖業的重要傳染病之一。

多殺性巴氏桿菌血清型眾多，按照莢膜抗原的不同可以被分為 A、B、D、E、F 五種血清型；按照脂多糖抗原的不同可以被分為 16 種血清型（1-16）。五種莢膜血清型和 16種脂多糖血清型又被分別劃分為五種莢膜基因型（A、B、D、E、F）和 8 種脂多糖基因型（L1-L8）。目前，根據我們團隊前期的研究結合參考文獻確定禽源多殺性巴氏桿菌的優勢莢膜型為A型，優勢脂多糖型為L1型，然而在實際工作中需要做三個PCR才能分別鑒定出多殺性巴氏桿菌、莢膜血清型和脂多糖血清型，費時費力且浪費耗材，鑒于此，本發明建立快速、簡便、敏感、特異的禽源多殺性巴氏桿菌及其血清型鑒定的多重PCR方法，旨在快速檢測臨床的疑似病例，還可用于血清型的鑒定，對于禽霍亂的分子流行病學調查具有重要的科學意義和應用價值。該多重PCR鑒定方法的建立對于禽霍亂的有效防控提供技術支撐，具有重大的現實意義。本發明的建立可填補國內外相關領域空白。

發明內容

本發明的目的是提供一種禽源多殺性巴氏桿菌及其血清型鑒定的多重PCR引物。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種用于禽源多殺性巴氏桿菌及其血清型鑒定的多重PCR引物，所述引物序列如下：

所述三組引物根據kmt1基因、編碼莢膜A型（capA）和脂多糖（LPS1）基因簇的保守序列來設計合適大小的片段，分別用于禽源多殺性巴氏桿菌及其血清型的鑒定。該引物組合不僅能準確地鑒定禽源多殺性巴氏桿菌，同時還能鑒定出它的血清型。

所述3組引物主要用來鑒定禽源多殺性巴氏桿菌和血清型。第一組引物所擴增的產物為編碼脂肪酶的基因，片段大小為230 bp；第二組引物所擴增的產物為編碼莢膜A型的基因，片段大小為529 bp；第三組引物所擴增的產物為編碼脂多糖LPS1型的基因，片段大小為763bp。

利用本發明的引物對PCR進行反應體系和反應條件的各種優化，建立一套可用于禽源多殺性巴氏桿菌及其血清型鑒定的多重PCR方法。

具體操作方法如下：

1、引物設計

參考NCBI 數據庫中kmt1基因、編碼莢膜A型（capA）和脂多糖（LPS1）基因簇的保守序列，利用Lasergene v 7.1 DNAStar軟件進行同源性分析比較，利用Oligo 7.0軟件，分別在保守區設計引物，并采用BLAST工具進行檢索，驗證其特異性。

2、反應體系的優化