[發明專利]直接核酸擴增試劑盒、試劑和方法

在審

• 申請號: 202110196732.2
• 申請日: 2013-10-23
• 公開（公告）號: CN112899354A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: J.K.霍爾頓;P.J.塔特內爾;K.L.拉梅頓
• 申請（專利權）人: 通用電氣醫療集團英國有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12M1/34;C12M1/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 羅文鋒;李唐

本發明涉及直接核酸擴增試劑盒、試劑和方法。具體而言，本發明涉及可用于擴增核酸的具有減少用戶的時間和可能的污染的優點的組合物、方法和試劑盒。本發明的干燥的試劑組合物可用來容易地處理和擴增核酸樣品。

本申請為分案申請，原申請的申請日為2013年10月23日，申請號為201380055445.3(PCT/EP2013/072206)，發明名稱為“直接核酸擴增試劑盒、試劑和方法”。

發明領域

本發明涉及核酸擴增的領域，特別是涉及使用聚合酶鏈反應擴增核酸的用途。為容易地擴增核酸樣品，本發明提供可用于通過凍干或冷凍-干燥核酸擴增試劑擴增核酸的方法和試劑盒。本發明具有在容易地處理核酸中的應用和在基因分型、診斷和法醫方面是特別有用的。

發明背景

聚合酶鏈反應(PCR)是用于分子生物學供擴增核酸的常見工具。US4683202(Mullis, Cetus Corporation)描述了用于擴增在核酸或其混合物中所含的任何所需特定核酸序列的方法。

US5705345 (Lundin等人)描述了核酸制備的方法，其中含有細胞的樣品被溶胞以釋放核酸和樣品用環糊精處理以中和萃取劑。這種系統的優點是傳統的去垢劑去除需要一個分離步驟；然而加入環糊精以中和去垢劑排除了對分離步驟的需要，因此減少了污染的危險。

WO9938962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述了一種具有結合的溶胞試劑的固體支持體。溶胞試劑可包含去垢劑、螯合劑、水和任選的RNA消化酶。用于PCR擴增的方法需要純化核酸用于擴增分析的其它步驟。

WO9102040 (Kosak)描述了在擴增反應混合物中使用環糊精標記的引物用于定性和定量核酸序列分析的發明。該發明的益處是更高的信號效率和標記顏色的通用性。

WO9532739 (Agrawal)描述了與環糊精非共價復合的寡核苷酸。然而環糊精與寡核苷酸的結合是用于寡核苷酸的細胞攝取而不用于PCR反應中的核苷酸的擴增。

WO2010066908 (Beckers等人,)描述了環糊精改進PCR的特異性、靈敏度和/或產率的用途。該方法公開在包含至少一種環糊精的反應混合物中進行的擴增反應且該擴增反應在反應混合物上進行。該PCT申請公開了用于在樣品中擴增目標核酸的試劑盒，所述試劑盒在同一容器中包含至少一種環糊精和至少一種選自PCR試劑列表的成分。該申請還公開試劑盒可作為包含幾種成分的預混合物提供，其也可以脫水的凍干的形式提供。然而，該申請中沒有這樣凍干的預混合試劑盒或者甚至此類試劑盒可如何制備的實例。

用于DNA擴增的當前方法涉及通常包含幾個步驟的DNA純化程序，其增加污染的機會。這是一個繁瑣的過程，而現有技術的方法在成本、復雜性和特別是用戶的時間方面具有許多明顯的缺點。例如，基于柱的核酸純化是典型的純化核酸的固相提取方法。這種方法依賴于通過吸附結合于二氧化硅或其它支持體(取決于緩沖液的pH和鹽含量)的核酸。合適的緩沖液的實例包括Tris-EDTA (TE)緩沖液或磷酸鹽緩沖液(由于反應性胺而用于DNA微陣列實驗)。在這樣的離心柱(spin column)上的核酸純化包括許多復雜和繁瑣的步驟。在離心柱上的核酸純化通常包括3個耗時和復雜的步驟/階段：

將含有核酸的樣品加入到柱中和由于結合溶液的較低的pH (相對于在柱上的硅烷醇基)和鹽濃度所致核酸結合，所述結合溶液可含有緩沖液、變性劑(如鹽酸胍)、TritonX-100、異丙醇和pH指示劑；

用5 mM KPO₄ pH 8.0或類似的，80% EtOH)洗滌柱；和

用緩沖液或水洗脫柱。

備選方法包括在離液劑的存在下核酸的結合，以致DNA結合于二氧化硅或玻璃顆粒或玻璃珠。這個屬性被用于在堿性條件下使用玻璃粉末或二氧化硅珠純化核酸。典型的離液劑包括硫氰酸胍或鹽酸胍，最近玻璃珠已被含有玻璃的微柱取代。