[發明專利]一種分子信標探針及其在制備檢測circBART2.2制劑中的應用和試劑盒

有效

• 申請號: 202110193823.0
• 申請日: 2021-02-21
• 公開（公告）號: CN112941154B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 熊煒;曲紅科;宋亞莉;郭燦;伍旭;曾朝陽;黃河;葛軍尚;劉凌云;周鳴;向波;李桂源
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12N15/11
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

本發明提供了一種分子信標探針及其在制備檢測circBART2.2制劑中的應用和試劑盒。該分子信標探針能與circBART2.2雜交，T7Exo再對雜交復合物進行酶切，釋放出來的熒光團使熒光信號增強，而釋放的circBART2.2繼續與分子信標探針雜交，實現循環，使熒光信號得到顯著增強，從而達到檢測circBART2.2的目的。該方法不需要復雜的儀器，操作簡便，特異性好、靈敏度高，具有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于環狀RNA檢測技術領域，具體涉及一種分子信標探針及其在制備檢測circBART2.2制劑中的應用和試劑盒。

背景技術

病毒編碼的circRNA是近年來的研究熱點，EB病毒(EBV)是皰疹病毒科嗜淋巴細胞病毒屬的成員，基因組為DNA。EBV感染與淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌等多種癌癥密切相關，對EBV編碼的circRNA的靈敏檢測能夠為EBV相關疾病的早期診斷提供一些幫助。circBART2.2為EBV編碼的一種circRNA，它在淋巴瘤等的發生發展中具有重要作用，對其靈敏、準確地檢測有助于臨床上更好地了解疾病的發展進程，對其診療具有重要意義。

目前報道的circRNA檢測方法包括：實時熒光聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)、northern blotting、二代測序、微陣列分析法等，但它們都存在一定的局限性。qRT-PCR需要一個必要的逆轉錄步驟來獲得cDNA，然后是擴增步驟，這增加了實驗成本和設計的復雜性，還可能有假陽性結果；Northern blotting步驟多，雜交時間長，樣本量大，靈敏度不高；二代測序和微陣列技術檢測步驟繁瑣且所用費用高等都限制了其廣泛使用。

因此，研發新的高靈敏度、高特異性、低成本、高效簡潔的檢測方法及配套檢測工具是目前亟待解決的問題。

發明內容

本發明的首要目的是針對上述現有技術存在的問題和缺陷，提供一種用于檢測circBART2.2的分子信標探針MB。利用該分子信標探針能與circBART2.2特異性雜交，T7Exo能夠對雜交復合物進行酶切的特性，釋放的熒光團可以使熒光信號增強，而circBART2.2可以繼續與MB雜交，實現雜交、酶切、釋放的循環過程，使體系的熒光信號得到數倍增強，從而達到靈敏檢測circBART2.2的目的。

本發明的分子信標探針，序列為：BHQ1-ACG CCG GAC CTT GCC CGT TTT TTT GTCCGG-FAM。

本發明的次要目的是提供上述的分子信標探針在制備檢測circBART2.2制劑中的應用。

本發明的第三個目的是提供上述的分子信標探針在檢測circBART2.2中的應用。將分子信標探針加入到含有T7核酸外切酶和待檢測樣品的體系中反應，檢測熒光強度，通過標準曲線法獲得circBART2.2的濃度。

上述的應用，體系中T7核酸外切酶濃度為100-200U/ul；優選100U/ul。

上述的應用，體系中分子信標探針濃度為100-300nM，優選200nM。

上述的應用，反應溫度35-40℃，反應時間3-5h。

上述的應用，反應溫度37℃，反應時間3h。

上述的應用，反應體系中還需要加入buffer，RNase inhibitor，無酶水。

本發明方法排除診斷目的的應用。

本發明的第四個目的是一種檢測circBART2.2的試劑盒，包含上述的分子信標探針和T7核酸外切酶。

進一步地，還包括：buffer，RNase inhibitor，無酶水。