[發明專利]鑒別甘藍枯萎病致病菌生理小種類型的PCR引物及其應用

在審

• 申請號: 202110189560.6
• 申請日: 2021-02-19
• 公開（公告）號: CN112980984A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 呂紅豪;劉星;趙存保;方智遠;楊麗梅;莊木;張揚勇;王勇;季家磊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 北京百歐知識產權代理事務所(普通合伙) 11930
• 代理人: 鄒曉艷

1.用于鑒別甘藍枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌粘團專化型(Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans)生理小種的PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為：

上游引物Foc12-F：5'-ATGAACTTGATGGGGTTACCGAT-3'，

下游引物Foc12-R：5'-TTGTATTGCTGTTTGGGTGTACC-3'，

所述PCR引物擴增尖孢鐮刀菌粘團專化型兩個生理小種基因組，1號生理小種的特征條帶大小為225bp，2號生理小種的特征條帶大小為174bp。

2.用于鑒別甘藍枯萎病致病菌生理小種類型的試劑盒，其特征在于：包括權利要求1所述的PCR引物。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：還包括用于進行PCR擴增和/或PCR擴增產物電泳所需的試劑。

4.權利要求1所述的PCR引物或者權利要求2或3所述的試劑盒在如下(1)-(6)中任一方面的應用：

(1)鑒別或輔助鑒別待測菌株是否為甘藍枯萎病致病菌；

(2)制備鑒別或輔助鑒別待測菌株是否為甘藍枯萎病致病菌的產品；

(3)鑒別或輔助鑒別尖孢鐮刀菌粘團專化型1號生理小種和/或2號生理小種；

(4)制備鑒別或輔助鑒別尖孢鐮刀菌粘團專化型1號生理小種和/或2號生理小種的產品；

(5)檢測或輔助檢測待測樣品是否感染甘藍枯萎病致病菌；

(6)制備檢測或輔助檢測待測樣品是否感染甘藍枯萎病致病菌的產品。

5.鑒別甘藍枯萎病致病菌生理小種類型的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以待測菌株的基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的PCR引物或者權利要求2或3所述的試劑盒進行PCR擴增，得到PCR產物；

(2)電泳檢測得到的PCR產物；

(3)比較待測菌株與尖孢鐮刀菌粘團專化型標準的1號生理小種和2號生理小種菌株的電泳條帶的異同，電泳條帶與1號生理小種條帶大小一樣的待測菌株為1號生理小種，電泳條帶與2號生理小種條帶大小一樣的待測菌株為2號生理小種，所述尖孢鐮刀菌粘團專化型1號生理小種和2號生理小種標準菌株的分子標記特征電泳條帶分別為225bp和174bp。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反應體系中各物質濃度為：含MgCl₂15mmol/L的10×Buffer 0.1μL/μL，含A、G、C、T各2.5mmol/L的dNTP 0.08μL/μL，上下游引物各0.5μmol/L，Taq酶0.1U/μL，模板DNA 5ng/μL，溶劑為雙蒸水。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反應條件為：95℃預變性3min；95℃變性30s，53～62℃退火30s，72℃延伸45s，35個循環；72℃延伸5min。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述退火溫度為56℃。

9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述電泳為采用4％的聚丙烯酰胺凝膠，于160V恒功率電泳分離70分鐘，最后銀染顯色。