[發明專利]一種梅毒螺旋體重組抗原、制備及應用

有效

• 申請號: 202110187951.4
• 申請日: 2021-02-18
• 公開（公告）號: CN113004380B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 劉萬建;楊帆;李林;王婷;杜金芳;李文
• 申請（專利權）人: 青島碩景生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/20
• 分類號: C07K14/20;C12N15/31;C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;G01N33/571;G01N33/558;G01N33/68
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司 37241
• 代理人: 袁曉玲

本發明屬于梅毒螺旋體免疫檢測技術領域。在梅毒螺旋體檢測中，金標層析檢測方法存在靈敏度低、特異性差的問題，而現有的解決方案存在漏檢、檢測結果受干擾的問題，為此本發明提供一種梅毒螺旋體重組抗原TP34S、制備方法及其應用，以TP17外膜蛋白為基礎，通過對其進行定點氨基酸突變，并將二倍的基因序列連接到載體上，進行原核表達，使得TP17突變序列完成重復表達，使其抗原表位能夠充分有效暴露，防止漏檢，檢測的特異性及產品的穩定性有明顯的提高。

技術領域

本發明屬于梅毒螺旋體免疫檢測技術領域，具體涉及一種梅毒螺旋體重組抗原、制備及應用。

背景技術

梅毒螺旋體亦稱蒼白螺旋體(Treponemiapallidum，TP)是性病一一梅毒的病原體，臨床上常用血清學方法檢測梅毒螺旋體的感染。以往用非特異類脂質抗原(心磷脂)檢測抗心磷脂抗體作為梅毒螺旋體感染的標志，如性病研究實驗室(VDRL)法、不加熱血清反應素試驗(USR)和快速血漿反應素環狀試驗(RPR)等。這些方法雖較靈敏，但不特異，有假陽性反應，因而還需再進行確認試驗。

以梅毒螺旋體為抗原的特異性檢測方法有梅毒螺旋體熒光抗體吸附試驗(FTA-ABS)和梅毒螺旋體血凝試驗(TPHA)，其特異性和靈敏度均較高。但由于梅毒螺旋體培養困難，試劑的成本較高而且由于梅毒螺旋體抗原較復雜，與其他病原體，尤其是類似的螺旋體病(如雅司病)仍可有一定的非特異性反應。

鑒于以上情況，科學家們開始用重組蛋白質作抗原的特異性檢測方法。隨著科學技術的發展，梅毒全基因組序列已得到確定，隨著基因克隆技術的發展，用梅毒重組蛋白質為抗原的免疫測定方法也己被陸續應用，如免疫俘獲EIA(CE)測定法，雙抗原夾心測定法等。

目前梅毒螺旋體免疫學檢驗方法主要有利用雙抗原夾心法原理的酶聯免疫法、化學發光法、金標層析法等。

TP雙抗原夾心法原理是：在固相支持物上面包被第一抗原(即包被抗原)，加入待檢標本，以合適的方式引入標記有特殊標記物的第二抗原(即標記抗原)，假如標本中存在TP抗體，則TP抗體跟上述二種抗原，形成“包被抗原-TP抗體-標記抗原”的三明治結構，然后通過標記抗原上的標記物將信號放大，得出最終的判定結果。

酶聯免疫法及化學發光法法具有靈敏度高、準確率高的優點，但由于檢測時間長、操作復雜、需要借助多臺儀器、檢測樣本質量要求高，因此不適于即時檢驗(POCT)。

因此簡單、快速、特異、靈敏度高的金標層析檢測方法在梅毒螺旋體檢測中被開發應用。

但應用金標層析方法要做到靈敏度高、特異性好，關鍵在于包被抗原的質量，包被抗原的性能對免疫檢測的準確性有著決定性的影響。因此，在固相載體和包被方法限定的情況下，制備的包被抗原質量好壞是由抗原特點決定的，高質量的抗原需要具備的條件是：

(一)高吸附性，在免疫層析檢測中，蛋白吸附于固相載體上，作為待測樣本的捕獲試劑，由于檢測結果很大程度取決于捕獲試劑在固相載體上良好的吸附效果，因此蛋白在固相載體上均一、良好的吸附對檢測結果非常重要。而抗原自身的結構不同及帶電荷不同均對吸附效果有較大影響。

(二)特異性好，抗原特異性很大程度依賴于其選擇的抗原及表位，表達過程中是否正確折疊，以及抗原純度，一旦表位選擇不當或蛋白純度達不到標準，便可導致檢測結果的漏檢或者假陽。

(三)穩定性好，穩定性不好的抗原往往是因為發生聚集或者發生降解導致活性降低；而穩定性好的抗原，無論是在緩沖體系中儲存還是包被到固相載體上，在一定的極端條件，都不易發生活性的降低。

目前普遍存在的問題是很多抗原在包被到固相載體上以后，檢測結果不理想，存在由于吸附效果差導致的檢測線彌散現象，以及靈敏度低、特異性差，且穩定性實驗不合格。