[發明專利]單質粒CRISPR-Cas9基因編輯工具及在異化金屬還原菌中的應用

在審

• 申請號: 202110187530.1
• 申請日: 2021-02-18
• 公開（公告）號: CN112877350A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 俞漢青;范陽陽;湯強;劉東風
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/65;C12N15/55;C12R1/01
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 宋明;張瑩

本發明涉及一種耗時短，效率高的可控消除單質粒CRISPR?Cas9基因編輯工具，及其在異化金屬還原菌中的多重基因編輯中的應用。本發明進一步涉及改善異化金屬還原菌的胞外電子傳遞的方法，包括通過對同一菌株中Mtr傳導復合物的形成，黃素的合成和NADH的生成中的關鍵基因實現多重基因編輯，得到胞外電子傳遞能力增強的菌株。

技術領域

本發明屬于基因編輯領域，涉及一種單質粒可控消除CRISPR-Cas9基因編輯工具，及其在異化金屬還原菌的基因編輯中的應用，以及增強異化金屬還原菌的胞外電子傳遞的基因工程方法。

背景技術

異化金屬還原菌(Dissimilatory Metal Reducing Bacteria,DMRB)是一類利用胞外金屬氧化物進行呼吸并儲存能量用于生長、代謝的微生物。DMRB經底物代謝產生的電子通常需要經過復雜的電子傳遞網絡傳遞給胞外電子受體。除金屬氧化物外，DMRB還可以將電子傳遞給金屬離子、電極以及多種污染物。因此，它們在重金屬(包括放射性核素)去除、生態修復和能源回收中具有巨大的應用價值。

S.oneidensis MR-1是DMRB中研究最為廣泛的模式菌株之一，它通過Mtr(Metalreducing)呼吸途徑中的細胞色素c(c-Cyts)復合物、胞外黃素電子穿梭體將胞內底物代謝產生的電子傳遞到胞外金屬氧化物和污染物等電子受體。然而，由于野生型S.oneidensisMR-1的胞外電子傳遞(Extracellular Electron Transfer,EET)效率較低，限制了其在污染修復中的實際應用。

為了提高DMRB的EET能力，研究者已經開發出多種方法，如添加電子穿梭體和電子供體、優化黃素合成途徑、促進NADH電子池再生、調節胞內第二信使Cyclic-di-GMP生成等。雖然這些方法已經取得了一些有價值的進展，但由于缺乏可用的基因組編輯工具，DRMB合成生物工程方面仍處于起步階段。

目前，對于DMRB遺傳改造的研究大多是基于質粒完成的，需要抗生素來維持其穩定性，這不僅增加了潛在的使用成本，也會引起抗生素抗性基因的水平轉移。為滿足環境應用的實際需求，DMRB的基因工程應在無抗生素標記的條件下完成。因而，不涉及質粒、不使用相關抗生素標記物的基因組原位編輯，在DMRB基因工程中有巨大的研究價值和應用潛力。

CRISPR-Cas9/Cpf1(成簇的有規則間隔短回文重復序列)已經成為一個強大的基因組編輯工具，極大的擴展了真核和原核生物的基因工程。

經典的II型CRISPR系統來源于釀膿鏈球菌，包含了一個由RNA引導的核酸內切酶(spCas9)及一個由crRNA和tracrRNA組成的sgRNA。spCas9核酸內切酶基于PAM序列(前間隔序列鄰近基序，核酸序列形式為NGG)和N20序列(前間隔序列，為PAM序列5'端的20個堿基)靶向目標DNA序列，并在PAM序列相鄰的位點切割DNA序列，啟動胞內DNA修復程序。在DNA修復模板存在時，可促使同源重組的修復發生，進而實現任意基因組位點的精確編輯。

發明內容

發明人建立了一個工程化的高效可控消除單質粒基因編輯工具Easy-to-editCRISPR-Cas9，并利用其在S.oneidensis MR-1中進行了多基因編輯，獲得了EET能力大幅提升的S.oneidensis MR-1菌株，實現了基因組范圍內的工程設計和EET網絡優化。

具體而言，例如，在該基因編輯工具中包含控制消除模塊，編輯蛋白模塊，目標操作模塊和骨架模塊，其中，

控制消除模塊含有嚴謹調控型啟動子和歸巢核酸內切酶(例如，I-SceI核酸內切酶)編碼基因的核心區域，分別位于核心區域兩端的終止子，及分別位于兩個終止子外端的歸巢核酸內切酶識別序列，目標操作模塊中，在上游同源臂與下游同源臂之間含有用于插入目標基因片段的位點。