[發明專利]一種雞原代軟骨細胞分離培養及鑒定的方法

在審

• 申請號: 202110184800.3
• 申請日: 2021-02-10
• 公開（公告）號: CN112877283A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 金四華;何培莉;邱桂如;耿照玉;夏晶晶;朱一笑;稅斐;賈羽晴;江洪峰;鄭書麗
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;G01N21/64;G01N33/573;G01N33/569
• 代理公司: 合肥市道爾知識產權代理有限公司 34169
• 代理人: 石佩

1.一種雞原代軟骨細胞分離培養的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將雞胚用75％酒精消毒后，用鑷子敲碎氣室端蛋殼，挑出整個雞胚置于裝有37℃的不含鈣鎂的PBS溶液的無菌培養皿中沖洗干凈，然后分離腿部轉移至干凈的培養皿中，用鑷子和手術剪剪去除軟骨外的肌肉和骨膜，分離出軟骨，將軟骨組織剪碎后進行離心處理，棄上清液；

(2)在剪碎的軟骨組織碎片中加入胰蛋白酶，在37℃水浴中進行消化處理，期間每隔10min輕搖離心管幾次，然后加入純胎牛血清終止消化，離心后棄上清，再加入Ⅱ型膠原酶，水浴消化至組織塊呈懸濁狀，期間每隔10min輕顛離心管幾次；

(3)將上述懸濁液用細胞篩網過濾，將過濾后的濾液離心處理后棄去上清液，加入完全培養液，巴氏吸管輕輕吹打使細胞均勻重懸利用，得到軟骨細胞；

(4)將分離的軟骨細胞接種于細胞培養皿中，在37℃、5％CO₂的培養箱中培養。

2.根據權利要求1所述的一種雞原代軟骨細胞分離培養的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的雞胚的胚齡為15天，離心轉速為1000r/min，離心時間為5min。

3.根據權利要求1所述的一種雞原代軟骨細胞分離培養的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的胰蛋白酶的質量濃度為0.25％，Ⅱ型膠原酶的質量濃度為0.2％，消化時間均為30-40min。

4.根據權利要求1所述的一種雞原代軟骨細胞分離培養的方法，其特征在于：所述步驟(3)中的細胞篩網的目數為200目，離心轉速為800-1000r/min，離心時間為4-6min。

5.根據權利要求1所述的一種雞原代軟骨細胞分離培養的方法，其特征在于：所述步驟(4)中的軟骨細胞按照1×10⁴個/孔的密度鋪板細胞培養皿。

6.一種雞原代軟骨細胞的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)雞原代軟骨細胞培養至第3天時，制作細胞爬片，將細胞接種至12孔板中，放入培養箱中；細胞爬片第二天棄去培養液，利用溫育的PBS溶液沖洗兩次，加入細胞固定液，細胞固定后，棄去固定液，利用PBS清洗3次；

(2)PBS清洗之后，加入封閉液，室溫靜置，棄去封閉液，PBS清洗3次，加一抗過夜；

(3)將一抗回收，PBS清洗3次，然后加入二抗，室溫靜置后棄去二抗，PBS清洗；

(4)加DAPI復染，室溫靜置后棄去DAPI，PBS清洗后加入少量PBS于培養孔中；在載玻片上加抗熒光淬滅劑，從培養孔中取出玻片鋪于載玻片上，熒光顯微鏡下拍照。

7.根據權利要求6所述的一種雞原代軟骨細胞的鑒定方法，其特征在于：所述步驟(1)中，加入細胞固定液后，細胞在室溫固定15-20min。

8.根據權利要求6所述的一種雞原代軟骨細胞的鑒定方法，其特征在于：所述步驟(2)中，加入封閉液后細胞在室溫下封閉2h，一抗在4℃條件下孵育過夜。

9.根據權利要求6所述的一種雞原代軟骨細胞的鑒定方法，其特征在于：所述步驟(3)中在避光條件下加入二抗，室溫靜置2h。

10.根據權利要求6所述的一種雞原代軟骨細胞的鑒定方法，其特征在于：所述步驟(4)中的DAPI復染時間為5-10min。