[發(fā)明專利]特異性識(shí)別FPV的核酸適配體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110181446.9
• 申請(qǐng)日: 2021-02-08
• 公開（公告）號(hào): CN112852824B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉家森;曲連東;康洪濤;姜騫;郭東春;楊鳴發(fā);田進(jìn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所(中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心哈爾濱分中心)
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;C12N15/10;C12N15/11;C40B40/06
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務(wù)所(普通合伙) 23210
• 代理人: 何強(qiáng)

特異性識(shí)別FPV的核酸適配體，它涉及一種核酸適配體。本發(fā)明的目的是提供一種特異性識(shí)別FPV的核酸適配體。本發(fā)明特異性識(shí)別FPV的核酸適配體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明特異性識(shí)別FPV的核酸適配體80個(gè)核苷酸組成，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明公開了一種特異性識(shí)別FPV的核酸適配體，該核酸適配體具有良好的親和力和特異性，可人工合成，因而成本低、生產(chǎn)周期短、不同批次間的重復(fù)性較好，其穩(wěn)定性也較高，可長(zhǎng)期保存，也便于化學(xué)修飾。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種核酸適配體。

背景技術(shù)

貓細(xì)小病毒(feline?parvovirus，F(xiàn)PV)屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒屬(Parvovirus)，單股無囊膜線狀DNA病毒，主要感染家貓與其他貓科動(dòng)物，也感染鼬科和烷熊科(包括烷熊、狐貍和水貂)等多種動(dòng)物。能引起高熱，嘔吐，腸炎，白細(xì)胞減少等典型的急性，高度接觸性疾病，死亡率60％～70％。易感動(dòng)物一旦發(fā)病，便會(huì)立即在周圍環(huán)境中廣泛的流行，呈急性經(jīng)過或地方性流行，造成非常高的死亡率。

核酸適體是指利用SELEX技術(shù)從人工合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選出的對(duì)靶標(biāo)具有特異性相互作用的單鏈DNA或RNA。核酸適配體的某些性質(zhì)與抗體很類似，幾乎可以應(yīng)用于抗體所涉及的一切領(lǐng)域，然而與抗體相比，它又具有自己獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：其具有靶分子范圍廣、分子質(zhì)量小、免疫原性低、易于化學(xué)合成、改造和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種特異性識(shí)別FPV的核酸適配體。

本發(fā)明特異性識(shí)別FPV的核酸適配體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發(fā)明特異性識(shí)別FPV的核酸適配體80個(gè)核苷酸組成，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明建立的FPV核酸適配體篩選隨機(jī)文庫為AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N(40)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA。

本發(fā)明適配體的正向引物序列為5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’；反向引物序列為5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。

本發(fā)明特異性識(shí)別FPV的核酸適配體的篩選方法：

一、初始FPV核酸適配體篩選隨機(jī)文庫的構(gòu)建：隨機(jī)文庫為含有80個(gè)堿基的單鏈DNA(ssDNA)文庫，中間40個(gè)為隨機(jī)序列，兩邊為固定序列；隨機(jī)文庫為5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N(40)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’(80nt)；適配體上下游引物分別為5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’和5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’；

二、核酸適配體的篩選：

2.1、FPV與NHS瓊脂糖磁珠偶聯(lián)制備FPV-磁珠混合物；

2.2、將隨機(jī)文庫與FPV-磁珠混合物孵育，之后用PBS洗脫未結(jié)合在FPV-磁珠上的ssDNA；

2.3、洗脫結(jié)合在FPV-磁珠上的ssDNA，將收集到的ssDNA乙醇沉淀，并重新重懸于超純水中，作為PCR反應(yīng)的模板；

2.4、進(jìn)行PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，在最優(yōu)的PCR條件下，用Biotion標(biāo)記的上游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

其中用鏈霉親和素磁珠將Biotion標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物拆分成ssDNA，作為下一輪篩選的文庫；

三、克隆測(cè)序：

經(jīng)過N輪篩選，得到了一組高親和力核酸適配體；利用無修飾適配體上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，切膠純化回收，進(jìn)行克隆測(cè)序；

四、候選適配體的篩選：采用Dot-blot方法篩選候選適配體；