[發(fā)明專利]一種高特異性檢測嗜肺軍團菌的核酸適配體及其檢測方法與應用

有效

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• 申請日: 2021-02-08
• 公開（公告）號: CN112941079B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設計）人: 夏銘辰;陳宣萌;陳育誼;孫昀皓;王慶琳
• 申請（專利權）人: 深圳市尚康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/569;G01N33/58
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發(fā)明涉及防控高致病性微生物領域，尤其涉及一種高特異性檢測嗜肺軍團菌的核酸適配體及其檢測方法與應用。本發(fā)明的核酸適配體包括GGTACTTCC、GGGCA莖環(huán)結構和TGAAGTGTTTAGGA結構。本發(fā)明的高特異性識別嗜肺軍團菌的核酸適配體，在熒光檢測結果和解離常數(shù)檢測結果中能夠表現(xiàn)出對軍團菌的選擇性結合，表現(xiàn)出高特異性、高親和力和高結合性，可以運用基于核酸適配體的嗜肺軍團菌檢測系統(tǒng)完成嗜肺軍團菌及其相近種屬的快速檢測需要，防控高致病性微生物，對于有效的監(jiān)控防治公共衛(wèi)生環(huán)境中的嗜肺軍團菌具有著十分重要的意義。

技術領域

本發(fā)明涉及防控高致病性微生物領域，尤其涉及一種高特異性檢測嗜肺軍團菌的核酸適配體及其檢測方法與應用。

背景技術

嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)是近年來在世界各地頻繁報道的一種革蘭氏陰性條件致病菌。軍團菌病最早于1976年首次報道。當年的7月23日，在美國費城召開的退伍軍人大會上爆發(fā)了大規(guī)模的感染，導致22人死亡，數(shù)百人出現(xiàn)非典型肺炎的癥狀。次年，美國疾病預防控制中心(CDC)的科學家從病人的肺組織分離出致病的元兇：軍團病桿菌(Legionnaires’disease bacterium,LDB)。1979年，美國CDC將軍團病桿菌正式命名為嗜肺軍團菌。此后世界各地時有軍團菌病暴發(fā)的報道，我國也于1982年首次報道了軍團菌感染的臨床病例。

軍團菌感染人類的主要途徑是中央空調冷卻塔工作時形成的含菌氣溶膠。當免疫力低下的人群吸入含有軍團菌的氣溶膠時，軍團菌會進入到肺部并感染肺泡巨噬細胞(Alveolar macrophage)，在其中增殖并擴散，引起可致命的急性呼吸道傳染病。我國衛(wèi)生部頒布的WS 394-2012《公共場所集中空調通風系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》4.3中明確規(guī)定公共場所集中空調中不得檢出嗜肺軍團菌。但隨著城鎮(zhèn)的現(xiàn)代化程度越來越高，集中空調和供水系統(tǒng)等設施的使用范圍不斷擴大，由此而帶來的軍團菌病的潛在危害性也大大增加。尤其是在我國南方，夏季長時間開空調，封閉的公共場所里軍團菌病更容易擴散傳播，如何針對環(huán)境中及人體內的嗜肺軍團菌進行快速的特異性檢測是目前亟待解決的問題。

目前已有多種方法應用于軍團菌的檢測鑒定，這些方法都存在許多缺陷和局限性。首先，針對環(huán)境中的嗜肺軍團菌的檢測，GB/T 18204.5-2013《公共場所衛(wèi)生檢驗方法第5部分：集中空調通風系統(tǒng)》規(guī)定水中及空氣中的嗜肺軍團菌檢測方法為分離培養(yǎng)法配合生化反應、血清分型鑒定，但由于嗜肺軍團菌不易生長，分離培養(yǎng)很難得到嗜肺軍團菌，研究表明該方法敏感度為10％～80％，穩(wěn)定性和重復性差，導致該方法檢測假陰性率很高，并且該方法檢測周期為3-14天，檢測時間非常長，不具有檢測時效性。其次，針對人體感染嗜肺軍團菌后的檢測WS 195-2001《軍團病診斷標準及處理原則》中規(guī)定的方法包括分離培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、擴增法(PCR)三大類。分離培養(yǎng)法的缺陷已經在上述說明，酶聯(lián)免疫吸附法存在靈敏度低的缺陷，檢測限一般≥1000CFU/mL。擴增法(PCR)需要昂貴的儀器設備，并且操作過程極易產生交叉污染，造成假陽性的出現(xiàn)。

核酸適配體(Aptamer)是一類在體外篩選的，能與相應目標物專一并緊密結合的一類單鏈寡核苷酸序列。核酸適配體可單獨作為生物探針對目標生物進行檢測識別，其優(yōu)點在于：第一，特異性高，其單鏈寡核苷酸序列形成的二級或三級空間結構可與病原微生物表面復雜的靶結構(如表面抗原蛋白質空間結構、表面多糖類空間結構)特異性結合，從而達到捕捉和識別病源微生物的作用；第二，親和力強，核酸適配體形成的特異性空間結構可有效的結合在目標生物靶標上，不易脫落；第三，靈敏度高，核酸適配體生物探針對目標生物的靈敏度一般為10-100CFU/mL，相比ELISA的方法進步一個數(shù)量級；第四，反應快速，核酸適配體生物探針可在5-15分鐘內與目標生物快速結合，相比分離培養(yǎng)法3-14天檢測周期，大大縮短了時間；第五，經濟成本低容易制造，傳統(tǒng)的抗體蛋白(單抗及多抗)生物探針在產業(yè)化生產時制作過程復雜成本高，而核酸適配體生物探針產業(yè)化簡單，生產耗材成本低、制作過程簡單，在獲得序列順序后，通過基因編輯技術可大量生產。近年，學者們通過指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術(SELEX)，獲得了個別病原細菌的特異核酸適配體。相關已有研究結果見下表1。