[發明專利]冷凍保存有蹄類動物胚胎

在審

• 申請號: 202110178384.6
• 申請日: 2016-07-13
• 公開（公告）號: CN112961824A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: B·V·桑切斯
• 申請（專利權）人: 吉納斯公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/075;A01N1/02;A61D19/04
• 代理公司: 北京市君合律師事務所 11517
• 代理人: 趙昊;孫倩

1.一種制備體外生產的有蹄類動物胚胎的方法，所述方法包括步驟：

在第一孵育條件下體外孵育未成熟的卵母細胞以獲得成熟的卵母細胞；

使所述成熟的卵母細胞受精從而產生受精卵；

剝露所述受精卵；

在第二孵育條件下孵育所述受精卵以制備所述體外生產的有蹄類動物胚胎，所述第二孵育條件包括含5％氧(O₂)和5％二氧化碳(CO₂)的環境；

冷凍所述體外生產的有蹄類動物胚胎，其中所述冷凍包括以下步驟：

(1)在10℃和38℃之間的第一溫度下，在包含1.0-4M乙二醇的冷凍溶液中孵育所述胚胎5-30分鐘；

(2)將所述胚胎裝載到容器中，其包括添加：

i)第一解凍溶液至所述容器；

ii)第一氣泡和第二解凍溶液，其中所述第一氣泡分隔所述第一和第二解凍溶液；

iii)第二氣泡和冷凍溶液中的所述體外生產的有蹄類動物胚胎，其中所述第二氣泡分隔所述第二解凍溶液和冷凍溶液中的所述體外生產的有蹄類動物胚胎；

iv)第三氣泡；

v)第三解凍溶液，其中所述第三氣泡分隔冷凍溶液中的所述體外生產的有蹄類動物胚胎和所述第三解凍溶液；

vi)第四氣泡；和

vii)第四解凍溶液，其中所述第四氣泡分隔所述第三和第四解凍溶液，并且，所述第一、第二、第三和第四解凍溶液包含在等滲稀釋溶液中的乙二醇；

(3)將所述胚胎暴露于-2至-10℃的溫度，持續1分鐘至60分鐘的時間段；

(4)以每分鐘-0.2至-0.8℃的速度降低所述溫度，直到達到-30至-36℃的第二溫度；和

(5)將所述胚胎浸入液氮中儲存。

2.如權利要求1所述的方法，還包括在雌性中誘導排卵和從所述雌性的生殖系統抽吸所述未成熟的卵母細胞的步驟。

3.如權利要求1所述的方法，其中在所述第一孵育條件下體外孵育所述未成熟的卵母細胞包括：

在35-40℃下在存在3-9％CO₂和飽和濕度的條件下孵育所述未成熟的卵母細胞。

4.如權利要求1所述的方法，其中使所述成熟的卵母細胞受精的步驟持續20-24小時。

5.如權利要求4所述的方法，其中使所述成熟的卵母細胞受精的步驟是在存在5％O₂的條件下進行的。

6.如權利要求1所述的方法，其中所述的對受精卵的孵育持續5至9天，并且所述第二孵育條件包括在礦物油作用下，補充有牛血清白蛋白(BSA)的培養基。

7.如權利要求1所述的方法，其中所述乙二醇以約0.2至和約1.3摩爾之間的范圍內的最終濃度存在于冷凍溶液中。

8.如權利要求6所述的方法，其中所述培養基選自下組：C4培養基、SOF培養基、SOFaa培養基及其組合。

9.如權利要求1所述的方法，其中所述體外生產的有蹄類動物胚胎處于選自下組的發育階段：桑葚胚、早期胚泡、胚泡和擴張囊胚。

10.如權利要求1所述的方法，其中所述體外生產的有蹄類動物胚胎或未成熟的卵母細胞是選自下組的有蹄類動物的胚胎或卵母細胞：普通牛、瘤牛和瘤牛-普通牛的雜交品種。

11.如權利要求1所述的方法，還包括解凍所述冷凍的體外生產的有蹄類動物胚胎，所述方法包括：

將含有在冷凍溶液中的冷凍胚胎的容器暴露于第一解凍環境持續足以解凍所述解凍溶液的第一時間段；

將所述容器暴露于10℃和38℃之間的解凍溫度的第二解凍環境持續足以解凍所述冷凍溶液的第二時間段；和

在所述容器內混合所述解凍溶液、所述冷凍溶液和所述胚胎。