[發(fā)明專利]基于可視化BPE-ECL技術(shù)檢測大腸桿菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110173362.0
• 申請日: 2021-02-08
• 公開（公告）號: CN112964701B
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉元建;王敏惠;熊曉輝
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N21/64;G01N27/12;G01N33/569
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發(fā)明公開了基于免疫磁珠分離的試劑盒，以及該試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了基于可視化BPE?ECL技術(shù)檢測大腸桿菌濃度的方法。本發(fā)明內(nèi)容還公開了所述的試劑盒以及檢測方法在檢測食品中的大腸桿菌濃度的應(yīng)用。本發(fā)明建立的可視化BPE?ECL技術(shù)檢測大腸桿菌濃度的方法，可通過裸眼觀察待測樣品中是否存在大腸桿菌，它具有原理簡單、快速（實(shí)驗(yàn)周期為45 min）、特異性強(qiáng)、檢測靈敏度高（檢測限為10¹ CFU/mL）的優(yōu)點(diǎn)，其次其操作簡便，液體實(shí)際樣品（牛奶、自來水）無需進(jìn)行前處理，固體實(shí)際樣品（碎牛肉）按照國標(biāo)進(jìn)行簡單前處理；同時因無需在雙極電極表面進(jìn)行生物化學(xué)修飾，電極可以重復(fù)使用，能有效降低檢測成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于可視化BPE-ECL技術(shù)檢測大腸桿菌的方法，尤其涉及基于可視化BPE-ECL技術(shù)檢測大腸桿菌O157：H7濃度的方法。

背景技術(shù)

食源性致病菌，指在食品的加工和流通過程中引入的病原菌，這些病原菌在食品中存活、生長代謝引起食物的變質(zhì)和破壞，同時有些病原菌分泌有毒物質(zhì)，直接或間接導(dǎo)致人患病，常見的食源性病原菌有致病性大腸桿菌(特別是出血性大腸桿菌O157：H7)、空腸彎曲菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌、沙門氏菌等。食源性致病菌的危害并不隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展而減少，世界范圍內(nèi)的食品安全事件接連發(fā)生。食源性致病菌輕則導(dǎo)致惡心、嘔吐、發(fā)燒、腹瀉等，重則出現(xiàn)呼吸、神經(jīng)、循環(huán)系統(tǒng)的損傷，長期食用某些變質(zhì)食品會表現(xiàn)致畸、致癌、致突變的作用，具有嚴(yán)重的潛在作用。大腸桿菌O157：H7作為食源性致病菌之一，常常在受污染的食品如奶制品，葉用蔬菜等中發(fā)現(xiàn)它的身影，引起了社會各界的廣泛關(guān)注，因此開發(fā)一種快速、靈敏的用于檢測食品中大腸桿菌O157：H7的方法顯得尤為重要。

目前，檢測大腸桿菌O157：H7的方法十分繁多，傳統(tǒng)的平板計數(shù)法準(zhǔn)確但是耗費(fèi)太多的人力和材料，且時間太長，酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)較快但敏感度較低，PCR準(zhǔn)確但其操作復(fù)雜，需要技術(shù)熟練的操作人員。免疫磁分離技術(shù)(ImmunomagneticSeparation，IMS)是利用抗原抗體的特異性識別和納米磁珠的磁響應(yīng)性對目標(biāo)物進(jìn)行分離富集的技術(shù)。其擁有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分離速度快等優(yōu)點(diǎn)，可排除基質(zhì)對于后期檢測方法的影響，在食源性病原微生物的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。

近年來，聯(lián)用雙極電極和電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)制備的傳感器在生物分析(如小分子檢測)和臨床診斷(如腫瘤標(biāo)志物檢測)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究引發(fā)了熱烈關(guān)注。BPE-ECL技術(shù)大大降低了獲得和檢測信號的難度，與BPE結(jié)合，ECL保留了其靈敏度高、可控性好、儀器簡單、分析速度快，且可以獲得與反應(yīng)有關(guān)的多種信息等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)采用雙極電極進(jìn)行ECL檢測時，一方面，原本在雙極電極表面產(chǎn)生的電流信號直接轉(zhuǎn)變?yōu)楦讬z測的光信號，而且完全擺脫了導(dǎo)線的束縛；另一方面，ECL所獲得的光信號為發(fā)光物質(zhì)發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)所釋放，此過程與電極表面的法拉第過程直接相關(guān)，可以消除傳統(tǒng)電化學(xué)中充放電電流以及遷移電流等一系列背景電流的干擾。已有文獻(xiàn)報道BPE-ECL技術(shù)用于檢測黃曲霉毒素，在雙極電極陰極上發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，并結(jié)合HRP催化聚苯胺原位生成的原理，運(yùn)用聚苯胺這一電化學(xué)活性物質(zhì)可以引發(fā)ECL變化的性質(zhì)，定量檢測黃曲霉毒素，由于電化學(xué)反應(yīng)的靈敏度極高，在檢測黃曲霉毒素過程中需要嚴(yán)格控制其檢測環(huán)境等條件，重復(fù)性很難保證。在其他報道中，BPE-ECL技術(shù)被用于檢測前列腺特異抗原(PSA)，在雙極電極陰極端進(jìn)行金納米離子復(fù)合材料的功能界面的組裝，降低了單位樣品的檢測效率。雙極電極還可以通過其結(jié)構(gòu)將待檢測物和信號分子分隔開，不僅降低了雜質(zhì)引入的干擾，也為原位、活體檢測提供了一種可靠的手段。但是并沒有報道表明能夠不借助其他化學(xué)反應(yīng)直接利用菌株本身的特性聯(lián)用可視化BPE-ECL技術(shù)可以對食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測。

基于此，開發(fā)一種更為簡便的免疫磁分離技術(shù)與可視化BPE-ECL技術(shù)聯(lián)用用于定量檢測食品中大腸桿菌O157：H7的方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種基于免疫磁珠分離的試劑盒。