[發明專利]一種抗二硝基苯胺類除草劑小麥的構建方法

有效

• 申請號: 202110170842.1
• 申請日: 2021-02-08
• 公開（公告）號: CN112813094B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 馬長樂;韓化南;王萍萍;邵群
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/46;C12Q1/6895
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種抗二硝基苯胺類除草劑小麥的構建方法，其特征在于：步驟如下：

(1)鑒定小麥tubulin基因，鑒定小麥中與OsTubA2同源水平最高的成員，鑒定二硝基苯胺的潛在效應位點Met-212，并分析其鄰近序列保守性，評估其改造方案和編輯的可行性；

(2)改良腺嘌呤編輯器，創制小麥中高效的WhieABE8e編輯器，并利用其高效編輯小麥tubulin基因212位，獲得了Met-212-Thr的小麥tubulin突變體材料；

所述步驟(2)中WhieABE8e編輯器的構建方法如下：

使用編輯效率高的TadA*-nCas9 D10A構型；使用高效脫氨酶TadA*8e；在WhieABE8e的N端和C端分別添加bpNLS Bipartite-SV40-Nuclear-Localization-Signals，并在C端另添加nucleoplasmin NLS，從而強化編輯器導入細胞核的能力；根據小麥轉錄組數據計算密碼子偏好性，并使用最高使用頻率的密碼子逆翻譯WhieABE8e/7.1，提高其轉錄翻譯的效率；

通過構建GFP-mCherry報告系統，在小麥原生質體中瞬時表達WhieABE，檢測了編輯效果，僅表達WhieABE但未編輯為GFP的綠色熒光，表達WhieABE并編輯則同時顯示GFP和mCherry的綠光和紅光；通過流式細胞儀高效統計熒光細胞數目，并計算比例即發紅光細胞占具有綠光細胞的比例，WhieABE8e能夠成功編輯靶點，并且效率顯著優于WhieABE7.1即使用目前的流行脫氨酶版本TadA*7.10；

具體步驟如下：

(1)鑒定小麥tubulin基因，鑒定小麥中與OsTubA2同源水平最高的成員，鑒定二硝基苯胺的潛在效應位點Met-212，并分析其鄰近序列保守性，評估其改造方案和編輯的可行性：

根據OsTubA2的氨基酸序列，通過比對ensemblplant的小麥轉錄組數據庫，篩選到與其同源水平較高的基因，并根據同源水平構建系統進化樹，鑒定到同源水平最高的六個小麥tubulin基因位點，分別位于小麥染色體1A，1B，1D，4A，4B，4D；根據OsTubA2中Met-212鄰近氨基酸序列，對以上六個小麥tubulin基因進行序列保守型分析，發現存在同源性較高的Met-212位點，并且存在合適的PAM基序，設計sgRNA并使用ABE實現Met到Thr的預期編輯；由此，認為小麥中存在二硝基苯胺潛在抗性位點Met-212，并且能夠通過ABE進行編輯從而獲得抗性；

(2)改良腺嘌呤編輯器，創制小麥中高效的WhieABE8e編輯器，并利用其高效編輯小麥tubulin基因212位，獲得Met-212-Thr的小麥tubulin突變體材料：

使用該小麥高效編輯器WhieABE8e，使用Met-212保守區設計的sgRNA即sgRNA-TaTub作為引導，對農桿菌介導轉化的小麥穩轉系進行編輯；通過Basta即WhieABE8e/7.1載體上帶有Basta抗性基因BlpR抗性篩選，并針對nCas9進行PCR，篩選到成功轉入WhieABE8e-sgRNA-TaTub的小麥轉基因株系；通過Sanger測序，鑒定到陽性轉基因小麥株系的tubulin基因成功發生預期編輯，即得抗二硝基苯胺類除草劑小麥；

所述步驟(2)中小麥轉基因株系為常見春麥品系Fielder。