[發明專利]一種毛乳頭細胞外泌體制備分離方法

有效

• 申請號: 202110168593.2
• 申請日: 2021-02-07
• 公開（公告）號: CN112920988B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 王雪瑩;陳繼冰
• 申請（專利權）人: 廣州四葉草健康科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本申請涉及外泌體提取領域，更具體地說，它涉及一種毛乳頭細胞外泌體制備分離方法，通過先對毛乳頭細胞進行培養和初步分離后，通過PEG修飾殼聚糖偶聯其中的外泌體，再通過蛋白酶對大分子蛋白進行消化，離心分離后再通過酶解法降解殼聚糖，最終得到外泌體。上述方案可以有效提高制備分離得到的外泌體的產量和純度。

技術領域

本申請涉及外泌體提取領域，更具體地說，它涉及一種毛乳頭細胞外泌體制備分離方法。

背景技術

毛乳頭細胞是一類位于毛囊底部的細胞，在毛囊的形成和毛發生長方面發揮核心作用。通過毛乳頭細胞提取得到的毛乳頭細胞外泌體是一類30～150nm的細胞外囊泡，富含mRNA、微小RNA和蛋白質，頭皮注射具有促進頭發再生以及生長的功能，可在基因和蛋白質水平調節毛囊的生發功能，幾乎不會引起同種異體排斥現象，因此被認為是毛發移植和干細胞療法的最佳替代方法。

差速離心法也稱超速離心法，是一種用于從細胞中分離外泌體的重要方法，也是目前最常用的方法之一。其原理在于通過不同的離心速率，對細胞培養后的上清液進行逐步分離，通過不同的離心速率分離其中的不同成分，進而得到外泌體。

在采用差速離心法的過程中，體系中部分較大分子的蛋白容易混雜于外泌體中，難以通過差速離心法進行分離，進而影響了制得的外泌體的純度。且在上述過程中，分離過程外泌體較難從體系中離心出來，產量有待提升。

發明內容

為了提高外泌體分離后的純度，減少分離過程的損失，本申請提供一種毛乳頭細胞外泌體制備分離方法。

本申請提供的一種毛乳頭細胞外泌體制備分離方法采用如下的技術方案：

一種毛乳頭細胞外泌體制備分離方法，具體包括如下步驟：

S1、采用懸浮培養的方式對毛乳頭細胞進行擴增培養；

S2、將擴增培養后的毛乳頭細胞換用無血清培養基，進行饑餓培養；

S3、取饑餓培養體系中的培養基部分，過濾除去細胞和細胞碎片，得到第一分離液；

S4、在4±0.5℃下，對第一分離液，250～300g離心5～15min，保留上清液，得到第二分離液；

S5、在4±0.5℃下，對第二分離液，1500～2500g離心18～25min，保留上清液，得到第三分離液；

S6、對4±0.5℃下，對第三分離液，8000～10000g離心25～35min，保留上清液，得到第四分離液，

S7、向第四分離液中，以30～200μg/mL的量加入PEG修飾殼聚糖，充分混合，通過PEG修飾殼聚糖對外泌體進行連接；

S8、加入蛋白酶，對體系中大分子蛋白進行消化；

S9、重新降溫至4±0.5℃，離心分離連接有PEG修飾殼聚糖的外泌體；

S10、對步驟S8中離心得到的沉淀進行重新分散，通過酶解法，分解外泌體表面連接的PEG修飾殼聚糖；

S11、再次離心，保留底部沉淀，得到外泌體。

在上述技術方案中，首先對毛乳頭細胞進行擴增和饑餓培養，在饑餓培養過程中，毛乳頭細胞會分泌外泌體，這構成了毛乳頭外泌體的產生基礎。

通過提取培養基部分，并過濾除去細胞和細胞碎片，得到的第一分離液中含有外泌體和其他雜質，隨后第一分離液通過初步的梯度離心得到第四分離液，目的在于除去其中的殘留的細胞碎片和較大的蛋白團，過濾完成之后加入PEG修飾殼聚糖，充分混合后，通過殼聚糖表面的PEG鏈與外泌體上的結合點位進行結合，形成外泌體-殼聚糖復合結構。