[發明專利]Lgr5基因在保護內耳毛細胞及促進支持細胞再生上的應用

在審

• 申請號: 202110168127.4
• 申請日: 2021-02-07
• 公開（公告）號: CN113151286A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 柴人杰;張李燕;高下;唐明亮;張莎莎
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/861;C12N5/10;G01N33/569
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 殷星

1.Lgr5基因在保護內耳毛細胞及促進支持細胞再生上的應用，其特征在于，所述Lgr5的C端具有如SEQ NO.4所示的核苷酸序列，且N端的第190位具有編碼丙氨酸的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，Lgr5基因的C末端823位氨基酸后被全部被截斷，N端第190位氨基酸丙氨酸突變為天冬氨酸后，并將全長的Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr)構建為腺病毒后備用，且這四種腺病毒均可發出紅色熒光；

步驟2，在類毛細胞系HEI-OC1細胞中分別加入Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr),通過對細胞進行染色，記錄細胞的生長情況；

步驟3，對轉染了Lgr5腺病毒、Lgr5-C腺病毒、Lgr5-190腺病毒和RFP(Ctr) 腺病毒的類毛細胞HEI-OC1細胞進行RNA提取，并逆轉錄為cDNA通過QPCR檢測細胞RNA水平的凋亡情況，發現加入Lgr5-C后，促凋亡基因caspase8/9/12和Bax顯著增加，抗凋亡基因P21和Bcl2顯著降低，ROS相關基因Catalase顯著降低；

步驟4，選取P0-P3的Lgr5-EGFP-CreERT2/+轉基因小鼠，解剖耳蝸并取出基底膜，通過流式分選篩選出Lgr5陽性的支持細胞，分別加入不同轉染復數的Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr)，于低粘附的96孔板中培養5天，確定相關數據。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟2中染色采用的是通過PI/FITC凋亡試劑盒、tunel染色或DCFH-DA染色。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，當染色采用通過PI/FITC凋亡試劑盒或tunel染色時，可通過流式分析儀檢測細胞凋亡情況，并記錄細胞凋亡率。

5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，當染色采用DCFH-DA染色時，可檢測細胞ROS水平。

6.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述相關數據為轉染復數、細胞成球的大小及數目，或支持細胞分化為毛細胞的數量。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，當相關數據為細胞成球的大小及數目時，將低粘附的96孔板中培養5天，通過活細胞工作站拍攝，再通過imageJ軟件分別統計各組細胞成球的大小和數目。

8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，當相關數據為支持細胞分化為毛細胞的數量時，將在低粘附的96孔板中培養5天，隨后轉移到提前涂好laminin的四孔皿中進行貼壁分化培養10天，最后進行免疫熒光染色，免疫熒光結果顯示每組支持細胞分化為毛細胞的數量。