[發(fā)明專利]Lgr5基因在保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞及促進(jìn)支持細(xì)胞再生上的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110168127.4
• 申請(qǐng)日: 2021-02-07
• 公開（公告）號(hào): CN113151286A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柴人杰;張李燕;高下;唐明亮;張莎莎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/861;C12N5/10;G01N33/569
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 殷星

1.Lgr5基因在保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞及促進(jìn)支持細(xì)胞再生上的應(yīng)用，其特征在于，所述Lgr5的C端具有如SEQ NO.4所示的核苷酸序列，且N端的第190位具有編碼丙氨酸的核苷酸序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，Lgr5基因的C末端823位氨基酸后被全部被截?cái)啵琋端第190位氨基酸丙氨酸突變?yōu)樘於彼岷螅⑷L的Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr)構(gòu)建為腺病毒后備用，且這四種腺病毒均可發(fā)出紅色熒光；

步驟2，在類毛細(xì)胞系HEI-OC1細(xì)胞中分別加入Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr),通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，記錄細(xì)胞的生長情況；

步驟3，對(duì)轉(zhuǎn)染了Lgr5腺病毒、Lgr5-C腺病毒、Lgr5-190腺病毒和RFP(Ctr) 腺病毒的類毛細(xì)胞HEI-OC1細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA通過QPCR檢測(cè)細(xì)胞RNA水平的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)加入Lgr5-C后，促凋亡基因caspase8/9/12和Bax顯著增加，抗凋亡基因P21和Bcl2顯著降低，ROS相關(guān)基因Catalase顯著降低；

步驟4，選取P0-P3的Lgr5-EGFP-CreERT2/+轉(zhuǎn)基因小鼠，解剖耳蝸并取出基底膜，通過流式分選篩選出Lgr5陽性的支持細(xì)胞，分別加入不同轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)的Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr)，于低粘附的96孔板中培養(yǎng)5天，確定相關(guān)數(shù)據(jù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2中染色采用的是通過PI/FITC凋亡試劑盒、tunel染色或DCFH-DA染色。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)染色采用通過PI/FITC凋亡試劑盒或tunel染色時(shí)，可通過流式分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并記錄細(xì)胞凋亡率。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)染色采用DCFH-DA染色時(shí)，可檢測(cè)細(xì)胞ROS水平。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述相關(guān)數(shù)據(jù)為轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)、細(xì)胞成球的大小及數(shù)目，或支持細(xì)胞分化為毛細(xì)胞的數(shù)量。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)相關(guān)數(shù)據(jù)為細(xì)胞成球的大小及數(shù)目時(shí)，將低粘附的96孔板中培養(yǎng)5天，通過活細(xì)胞工作站拍攝，再通過imageJ軟件分別統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞成球的大小和數(shù)目。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)相關(guān)數(shù)據(jù)為支持細(xì)胞分化為毛細(xì)胞的數(shù)量時(shí)，將在低粘附的96孔板中培養(yǎng)5天，隨后轉(zhuǎn)移到提前涂好laminin的四孔皿中進(jìn)行貼壁分化培養(yǎng)10天，最后進(jìn)行免疫熒光染色，免疫熒光結(jié)果顯示每組支持細(xì)胞分化為毛細(xì)胞的數(shù)量。