[發明專利]一種薄殼山核桃果實活體接種的方法

有效

• 申請號: 202110157577.3
• 申請日: 2021-02-04
• 公開（公告）號: CN113040051B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 吳天昊;巨云為
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q1/18;A01H4/00
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天;邢少華

本發明公開了一種薄殼山核桃果實活體接種的方法，屬于生物工程技術領域。該方法包括以下步驟：1)挑選薄殼山核桃樹上的健康果實，消毒，刺傷果實待用；2)將致病菌株進行活化至菌絲布滿整個培養基，打取菌餅，有菌絲的一面貼緊果實的刺傷傷口處；使用菌餅覆蓋裝置蓋住菌餅用力按壓使其黏牢在果實上面；3)調查接種點的發病情況。其中，菌餅覆蓋裝置包括覆蓋管管體、覆蓋管管蓋和無菌脫脂棉，覆蓋管管體的底部封閉，并設有壓實的處于水飽和狀態的無菌脫脂棉，通過覆蓋管管蓋控制覆蓋管管體的開閉狀態。使用本發明的菌餅覆蓋裝置能夠對菌餅進行保濕，且能夠防止外界其他病原菌的浸染干擾結果，發病組織再分離致病菌株的分離率高。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種薄殼山核桃果實活體接種的方法。

背景技術

薄殼山核桃(Carya illinoinensis(Wangenh.)K.Koch)，又名美國山核桃、長山核桃，胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬(Carya)落葉喬木。其為優良的綠化樹種，木材上等的軍工用材，果實是理想的保健品。樹形高大挺拔，根系發達，耐水濕，干果、油料、綠化和用材于一身，具有較好的經濟效益、生態效益和社會效益。它被引種到我國已有100多年的歷史，是一個集經濟、社會和生態效益于一身的優良經濟樹種。

近幾年，隨著人們生活品質的日益提升，對堅果類食品的需求逐漸增多，薄殼山核桃種植面積不斷地擴大，同時，隨著集約化經營強度的增加，薄殼山核桃的病害也相對增多，嚴重的影響了生產者的利益，也制約著我國薄殼山核桃的質量和品質。其中薄殼山核桃黑斑病危害最為嚴重。該黑斑病為多種病原菌復合侵染引起的，通過組織分離法，將新鮮的病害組織用75％的酒精進行表面消毒，再用無菌水進行沖洗，用無菌的解剖刀將組織切成5mm的小塊，接種于PDA培養基上培養。通常，為了防止細菌污染，可以在培養基中加入卡那和氨芐等抗生素。培養3-5d后，取最邊緣的菌絲，挑一小塊移至新的培養基中進行純化。分離到的菌種主要有炭疽菌，擬盤多毛孢，擬莖點霉等，為了證明其是否為病原菌，需要進行一個菌種致病性的測定，將其接種到活體寄主上，觀測寄主是否發病。

常規的薄殼山核桃果實活體接種方法為將菌餅接放到果實上，用封口膜將菌餅封住纏繞在果實上，但其存在操作難度較高，操作時間長，封口膜受干易斷裂等問題。

發明內容

鑒于現有技術存在的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題在于提供一種薄殼山核桃果實活體接種的方法。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種薄殼山核桃果實活體接種的方法，包括以下步驟：

1)挑選薄殼山核桃樹上的健康果實，消毒，再用滅過菌的針管刺傷果實待用；

2)將致病菌株接種到PDA培養基上進行活化，至菌絲布滿整個培養基；用滅過菌的打孔器將PDA培養基中的菌絲切割成菌餅，有菌絲的一面貼緊果實的刺傷傷口處；使用菌餅覆蓋裝置蓋住菌餅用力按壓使其黏牢在果實上面；

3)調查接種點的發病情況；

菌餅覆蓋裝置包括覆蓋管管體、覆蓋管管蓋和無菌脫脂棉，覆蓋管管體的底部封閉，并設有壓實的無菌脫脂棉，無菌脫脂棉處于水飽和狀態，通過覆蓋管管蓋控制覆蓋管管體的開閉狀態。

進一步的，步驟1)中，挑選9～10月份的薄殼山核桃樹上的健康果實，用75％酒精消毒2min，無菌蒸餾水沖洗3次，再用滅過菌的針管刺傷果實待用。

進一步的，步驟2)中，將致病菌株接種到PDA培養基上進行活化，在25℃～28℃培養3-5d至菌絲布滿整個培養基。

進一步的，步驟2)中，致病菌株包括擬盤多毛孢、炭疽菌和擬莖點霉。

進一步的，步驟2)中，用滅過菌的打孔器將PDA培養基中的菌絲切割成5mm×5mm的菌餅。