[發明專利]一種應用數字PCR檢測EGFR L858R突變的引物及方法

在審

• 申請號: 202110153560.0
• 申請日: 2021-02-04
• 公開（公告）號: CN113151417A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 吳劍卿;吳雙雙;黃琦清;劉荻;尹煥才;沈勛然
• 申請（專利權）人: 江蘇省人民醫院（南京醫科大學第一附屬醫院）
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州言思嘉信專利代理事務所(普通合伙) 32385
• 代理人: 徐永雷

1.一種應用數字PCR檢測EGFR L858R突變的引物，其特征是：包括一對正向引物和反向引物和混合探針組；同時檢測野生型突變、突變型I和突變型II三種突變基因型。

2.如權利要求1所述應用數字PCR檢測EGFR L858R突變的引物，其特征是所述引物對具體如下：

正向引物: EGFR p.L858R-F 5'-ACACCGCAGCATGTCAAGA-3'；

反向引物: EGFR p.L858R-R 5'-TGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3'。

3.如權利要求1所述應用數字PCR檢測EGFR L858R突變的引物，其特征是：所述混合探針組包括為野生型探針、突變型I探針和突變型II探針；具體為：

野生型探針EGFR p.L858R-P-YS ATTTTGGGCTGGCC-5’HEX-3’MGB；

突變型I探針EGFR p.L858R c.2573TG-P-G ATTTTGGGCGGGCC-5’FAM-3’MGB；

突變型II探針EGFR p.L858R c.2573_2574TGGT-P-GT AGATTTTGGGCGTGCC-5’FAM-3’MGB和-5’HEX-3’MGB。

4.如權利要求1所述應用數字PCR檢測EGFR L858R突變的引物，其特征是：所述野生型序列如SEQ ID No.6所示；突變型I序列如SEQ ID No.7所示；突變型II序列如SEQ ID No.8所示。

5.一種應用數字PCR檢測EGFR L858R突變的引物，其特征是：應用于數字PCR檢測肺癌患者血液或者癌癥組織中EGFR L858R突變。

6.一種應用數字PCR檢測EGFR L858R突變的方法，其特征是步驟如下：

（1）使用商業化試劑盒提取腫瘤組織或者腫瘤患者血液中的基因組；

（2）按照如下體系配置ddPCR檢測用組分：

（3）將微滴生成卡放入微滴生成卡卡座，向中間一排細孔中每孔加入20μL反應體系；按照模板濃度從低到高的順序加入；將BioRad探針法微滴生成油70μL每孔加入生成卡最下面一排；在卡座上裝好密封墊后，放入微滴生成儀；微滴生成結束后，緩慢從最上面一排孔中吸出微滴轉移到八連管中；

（4）進行PCR熱循環，具體如下：首先在95℃加熱10min；隨后在95℃加熱30s，68℃加熱1min，重復進行上述加熱40個循環；98℃加熱10min；最后在12℃保溫，結束程序；PCR儀升降溫速率均為2℃/s；

（5）使用微滴讀數儀讀數并分析結果，最終得到模板濃度。

7.根據權利要求6所述應用數字PCR檢測EGFR L858R突變的方法，其特征是：步驟（2）中保存在-20℃的組分融化后需要在瞬時離心渦旋混勻；按照從上至下的順序分別加入各組分后，渦旋混勻待用。