[發(fā)明專利]一種文冠果花瓣瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110152421.6
• 申請(qǐng)日: 2021-02-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112852863B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉肖娟;畢泉鑫;王利兵;于海燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/29
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 齊寶玲

1.一種文冠果花瓣瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)取處于初花期的文冠果花序，放入80～120g/L的葡萄糖溶液中，移入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天；

(2)使用侵染液侵染文冠果花瓣：

用無(wú)菌針30度傾斜輕刺花瓣基部偏上1～2cm處的表面薄膜，用無(wú)菌注射器吸取所述侵染液，對(duì)準(zhǔn)傷口部位緩慢注入花瓣中，并使所述侵染液浸潤(rùn)整個(gè)花瓣；

所述侵染液中包括如下質(zhì)量濃度的成分：IL-60-BS 2～5μg/mL、pIR-目的基因8～12μg/mL、MgCl₂ 10mM、MES 10mM、Ace 40～60μM和葡萄糖3～6％；

(3)將侵染后的文冠果花序依次放入40～60g/L和80～120g/L的葡萄糖溶液中培養(yǎng)：

將侵染后的文冠果花序放入40～60g/L的葡萄糖溶液中，室溫暗處培養(yǎng)12～24h；之后轉(zhuǎn)入80～120g/L的葡萄糖溶液中，置于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～4天；

(4)重復(fù)步驟(2)～(3)兩次，完成瞬時(shí)轉(zhuǎn)化；

(5)將完成瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的文冠果花序置于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7～10天。

2.如權(quán)利要求1所述的一種文冠果花瓣瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述pIR-目的基因的制備方法如下：

(1)擴(kuò)增目的基因片段并連接到PMD19-T克隆載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR驗(yàn)證，得到PMD-目的基因載體；

(2)將pIR空載體與PMD-目的基因載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，兩個(gè)回收產(chǎn)物使用連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR驗(yàn)證，得到pIR-目的基因載體；

(3)利用質(zhì)粒提取試劑盒提取pIR-目的基因載體，得到pIR-目的基因。

3.如權(quán)利要求2所述的一種文冠果花瓣瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述侵染液的配置方法為：向蒸餾水中加入IL-60-BS、pIR-目的基因、MgCl₂、MES和葡萄糖，于暗處?kù)o置2～3h，使用前加入Ace。

4.如權(quán)利要求1～3任意所述的一種文冠果花瓣瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)，光照16h、黑暗8h交替培養(yǎng)。

5.如權(quán)利要求1～3任意所述的一種文冠果花瓣瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法在研究基因的花色調(diào)控機(jī)制中的應(yīng)用。