[發明專利]一種誘變菌種以及微生物發酵制備熊去氧膽酸的方法

在審

• 申請號: 202110150425.0
• 申請日: 2021-02-03
• 公開（公告）號: CN112795615A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 蔣紅平;唐杰;李斌;郭志軍
• 申請（專利權）人: 湖南醇康醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12P33/06
• 分類號: C12P33/06;C12N15/01;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 夏菁

本發明提供了一種微生物發酵制備熊去氧膽酸的方法，將新月彎孢菌ATCC 13432的誘變菌種經培養后接種至轉化培養基，對石膽酸進行發酵轉化，得到熊去氧膽酸。本發明提供了一種新的以石膽酸為原料，通過生物發酵制備熊去氧膽酸的方法，該方法未使用動物源提取，綠色環保，成本低，工藝步驟簡單，反應條件溫和，反應收率高，試劑簡單易得，適合工業化大規模生產。

技術領域

本發明涉及化學制藥技術領域，尤其涉及一種誘變菌種以及微生物發酵制備熊去氧膽酸的方法。

背景技術

熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic Acid，簡稱UDCA)是傳統名貴中藥熊膽的主要有效成分，化學名稱為3a,7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸，具有極強的促進脂肪和脂肪酸水解的作用，醫學上用于增加膽汁酸分泌，并使膽汁成分改變，降低膽汁中膽固醇及膽固醇酯，有利于膽結石中的膽固醇逐漸溶解，在臨床上主要用于治療各種肝膽疾病和消化道疾病，例如用于治療膽結石、膽汁淤積性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障礙、膽囊炎、膽道炎和膽汁性消化不良、膽汁返流性胃炎、眼部疾病等。

目前熊去氧膽酸的制備方法一般有如下幾種，一是通過活熊膽汁提取獲得，該方法由于來源有限或動物保護法限制而逐漸被淘汰；二是以動物膽酸類，例如豬膽酸、牛膽酸、鵝去氧膽酸等為原料通過合成的方法制備，這些方法存在原料來源有限，反應步驟長，產率低等問題；三是以雄甾烯二酮為原料的合成方法，Helvetica.Chimica Acta.1984.67(2)612報道了以雄甾烯二酮原料，經九步反應制備熊去氧膽酸，該方法雖屬非動物膽酸的原料制備的方法，但其價格較貴，合成中引進側鏈的難度大；四是通過酶法制備，中國專利CN109154016A報道了以石膽酸為底物，加入氧化性或還原性輔酶、醇脫氫酶、羥化酶進行反應制備熊去氧膽酸。在該反應中需要用到輔酶，輔酶價格昂貴，成本高，另外，該技術的羥化酶是從菌體分離得到，價格昂貴，僅適合實驗階段研究，工業化可行性不大。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種誘變菌種以及微生物發酵制備熊去氧膽酸的方法，具有較高的反應收率。

為達到上述目的，本發明提供了一種微生物發酵制備熊去氧膽酸的方法，將新月彎孢菌ATCC 13432的誘變菌種經培養后接種至轉化培養基，對石膽酸進行發酵轉化，得到熊去氧膽酸。

上述反應的方程式如下：

本發明以石膽酸為底物，通過新月彎孢菌(Curvularia lunata)ATCC 13432的誘變菌種生物發酵的方法在石膽酸的7位上引入β構型羥基，經簡單后處理后得到產率高、純度高的熊去氧膽酸，本方法成本低，工藝步驟簡單，反應條件溫和，反應收率高，試劑簡單易得，適合工業化大規模生產。

本發明優選的，所述新月彎孢菌ATCC 13432的誘變菌種的誘變方法為：以新月彎孢菌ATCC 13432為出發菌種，經過斜面培養，收集孢子制備孢子懸液，加入亞硝基胍進行誘變處理，將誘變后的菌懸液稀釋后涂布于固體平板培養基上，挑選單菌落進行石膽酸發酵，檢測熊去氧膽酸的產量，得到能產生熊去氧膽酸的目標誘變菌種。

上述新月彎孢菌ATCC 13432的來源為美國菌種保藏中心。

本發明優選的，所述發酵轉化方法為：將新月彎孢菌ATCC 13432的誘變菌種經斜面培養、一級種子培養和二級種子培養后加入轉化培養基中，經菌體預培養后開始轉化，菌體接種量為1％～10％，溫度為30～32℃，轉速100～400rpm，空氣流量0.1～0.4Nm³/h，壓力0.01～0.1MPa，轉化時間為24-72h。

本發明優選的，所述斜面培養的培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基。

本發明優選的，所述一級種子培養和二級種子培養的培養基配方為：玉米漿1～20g/L，葡萄糖10～50g/L，pH為6.0。