[發明專利]一種高通量通過檢測鈣信號判斷人精子質量的方法

在審

• 申請號: 202110146846.6
• 申請日: 2021-02-03
• 公開（公告）號: CN112858242A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 曾旭輝;彭利忠;顧亞云;張小寧;康杭;黃榮祖;姚兵
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28;G01N1/34;G01N1/30
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 黃欣

1.一種高通量通過檢測鈣信號判斷人精子質量的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1，人精液樣本的處理：將收集到的精液樣本水浴液化；

步驟2，清洗純化人精子：將步驟1的精液樣本用HS清洗，以去除精漿；

步驟3，Fluo-4 AM精子孵育染色：采用鈣熒光探針Fluo-4 AM 和Pluronic F-127對純化后的精子進行染色；

步驟4，向染色的精子中加入刺激物，然后采用多功能酶標儀檢測加入刺激物前后精子胞內鈣信號[Ca²⁺]_i的熒光值，根據精子胞內鈣信號[Ca²⁺]_i的熒光值變化，確定各刺激因子對人精子鈣信號[Ca²⁺]_i的影響，分析人精子樣本對各生理過程響應是否正常，從而判斷人精子質量。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1中水浴液化的條件是37℃水浴液化60 min。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2中清洗具體是：向1 mL精液中加入0.5 mL 預熱的HS溶液，混勻后，2000 rpm離心5 min，棄去上清，再加入1.0 mL HS溶液重懸，2000 rpm離心5 min，棄去上清，然后加入預熱的HS溶液重懸并調整精子濃度為1×10⁷個/mL以上。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3中染色具體是：向清洗純化后的精子中加入5 μM 鈣熒光探針Fluo-4 AM 和0.05% Pluronic F-127 的進行重懸混勻孵育，避光置于37℃、5 % CO₂條件下染色30 min，1800 rpm 離心 6 min，吸去上清液以去除精子細胞外殘留的染料，加入 HS溶液重懸精子沉淀，2000 rpm 離心 6 min，去除上清，重復一次，即得染色后的精子溶液。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟4中所述刺激物為NaHCO₃溶液、孕酮溶液、Bourgeonal溶液、前列腺素1-前列腺素2的混合溶液。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟4中多功能酶標儀的檢測條件為：激發波長502 nm，發散波長525 nm，溫度37℃。