[發(fā)明專利]一種HEK293細(xì)胞組合梯度培養(yǎng)基及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110144051.1
• 申請日: 2021-02-03
• 公開（公告）號: CN112501113B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖志華
• 申請（專利權(quán)）人: 上海奧浦邁生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

一種用于HEK293細(xì)胞的濃度梯度培養(yǎng)基組，包括培養(yǎng)時按時間順序添加的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基X，補(bǔ)料培養(yǎng)基Y，補(bǔ)料培養(yǎng)基Z；其中維生素，血清替代物中不同成分的濃度從基礎(chǔ)培養(yǎng)基到補(bǔ)料培養(yǎng)基Z呈不同變化趨勢，從而達(dá)到提高外源蛋白濃度、提高細(xì)胞穩(wěn)定性、提高包裝病毒滴度的效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體屬于HEK293細(xì)胞培養(yǎng)基領(lǐng)域。

背景技術(shù)

越來越多的基因和免疫療法獲批進(jìn)入臨床試驗(yàn)，無血清培養(yǎng)基成為抗體及重組蛋白生產(chǎn)的主要細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)基一般而言使用一次性加入的方式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，但有些工程類細(xì)胞種類除了承擔(dān)基礎(chǔ)代謝，還需要承擔(dān)人工引入外源物質(zhì)代謝，與特定信號通路的激活有關(guān)，需要多種物質(zhì)供應(yīng)，然而一次性加入所有的物質(zhì)以及直接達(dá)到最高濃度，可能會導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓過高，培養(yǎng)基過于黏稠，溶氧降低，影響細(xì)胞生長效率以及代謝物質(zhì)活性。分批補(bǔ)料可一定程度上解決上述問題。

現(xiàn)有技術(shù)中已有類似研究，EP592692B1即公開了一種293菌株培養(yǎng)方法，在初始細(xì)胞培養(yǎng)時維持一定鈣離子濃度，使細(xì)胞增殖到細(xì)胞密度為3倍左右時，向培養(yǎng)液中加入糖和鈣，基本上抑制細(xì)胞密度的增加以維持蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，繼續(xù)增加直到蛋白質(zhì)濃度不再顯著增加后停止培養(yǎng)。然而上述方法中細(xì)胞傾向于通過添加鈣鹽而聚集成團(tuán)塊，雖然細(xì)胞密度增加被抑制，然而實(shí)際培養(yǎng)中，有用蛋白的分泌依然一定程度上被抑制，并且影響溶氧，使得細(xì)胞生長狀態(tài)下降；CN106754817A公開了293細(xì)胞的分批培養(yǎng)表達(dá)重組ATX的方法，利用FreeStyle293表達(dá)培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，在24h、48h、60h進(jìn)行不同體積的補(bǔ)料，這種方式補(bǔ)料培養(yǎng)基都采用相同的成份，對于細(xì)胞不同的生長階段沒有針對性，對于外源蛋白的表達(dá)仍然沒有明顯的提高；CN102604889A法采用了適應(yīng)無血清培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞系，使用了漸進(jìn)式濃度以及血清含量的培養(yǎng)基，但其仍然采用基本相同的成分，沒有對具體營養(yǎng)成分進(jìn)行梯度優(yōu)化；崔玉等發(fā)現(xiàn)，在293細(xì)胞培養(yǎng)過程中，不同類型的氨基酸代謝隨著時間有一定變化，葡萄糖對293培養(yǎng)也有一定重要作用且不能被其他成份代替，調(diào)整培養(yǎng)基成份和細(xì)胞數(shù)量可以提高細(xì)胞的生長速率，但該文章僅考察了氨基酸變量并且只進(jìn)行了粗分類，也并沒有給出明確的培養(yǎng)基成份。Leticia Liste-Calleja等發(fā)現(xiàn)使用分批培養(yǎng)基添加培養(yǎng)293細(xì)胞，可以提高細(xì)胞密度，但其仍然局限于血清濃度的優(yōu)化以及逐步添加，并且細(xì)胞密度最高達(dá)到10⁶數(shù)量級。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可知，HEK293細(xì)胞是抗體和重組蛋白表達(dá)的重要平臺，但培養(yǎng)過程中，常常由于細(xì)胞株差異、環(huán)境差異等造成生長速度、密度、狀態(tài)降低，限制了表達(dá)藥物的質(zhì)量和產(chǎn)量。分批添加培養(yǎng)基可改善這一狀態(tài)，但現(xiàn)有技術(shù)中采用分批培養(yǎng)的技術(shù)仍然存在一定問題。因此優(yōu)化分批次的293細(xì)胞培養(yǎng)基是亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容