[發(fā)明專利]核酸快速擴(kuò)增和檢測的微流控芯片、檢測方法及系統(tǒng)

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110143572.5
• 申請日: 2021-02-02
• 公開（公告）號: CN112899152A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曲中天;王宏;張方舟;黃明壘;樊麗
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12M1/34;C12M1/00;C12Q1/6837;C12Q1/6844
• 代理公司: 南京利豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32256
• 代理人: 王茹;王鋒

1.一種核酸檢測用特異性編碼引物組，其特征在于包括至少一組引物對，所述引物對包括正向引物和反向引物，并且所述正向引物、反向引物中的任一者為特異性編碼的引物序列，而另一者為熒光基團(tuán)標(biāo)記的引物序列，所述特異性編碼的引物序列包括編碼區(qū)、間隔區(qū)、阻斷區(qū)和特異性引物區(qū)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測用特異性編碼引物組，其特征在于：所述編碼區(qū)的序列設(shè)計(jì)為具有相近長度和相近的優(yōu)化雜交溫度、而序列差異較大的編碼序列；和/或，所述間隔區(qū)包括含5～20堿基的無關(guān)序列，至少用于優(yōu)化擴(kuò)增和增加雜交效率，優(yōu)選為5～20個(gè)T；和/或，所述阻斷區(qū)用間臂修飾，至少用于阻斷DNA聚合酶合成，保證擴(kuò)增產(chǎn)物的編碼區(qū)和間隔區(qū)為單鏈，優(yōu)選的，所述阻斷區(qū)包括Spacer 3、Spacer 9、Spacer 18中的至少任一者；

和/或，所述特異性引物區(qū)為特異性引物序列，至少用于識別待檢測位點(diǎn)；其中，所述待檢測位點(diǎn)包括單堿基多態(tài)位點(diǎn)；3’端完全匹配的引物能夠被DNA聚合酶延伸，而3’端有錯(cuò)配的引物不能被DNA聚合酶延伸，且能夠?qū)⒆R別位點(diǎn)編碼為編碼序列；

優(yōu)選的，所述特異性引物序列3’端的第二位、第三位、第四位或第五位具有至少一個(gè)錯(cuò)配位點(diǎn)，至少用于降低DNA聚合酶識別的錯(cuò)誤率以增加檢測的特異性；

和/或，所述熒光基團(tuán)標(biāo)記的引物序列包括通用引物和5’端熒光標(biāo)記基團(tuán)；優(yōu)選的，所述熒光標(biāo)記基團(tuán)包括FAM、Cy3、Cy5、TAMRA、HEX中的至少任一者；

和/或，所述核酸檢測用特異性編碼引物組包括特異性編碼的正向引物和熒光基團(tuán)標(biāo)記的反向引物；或者，熒光基團(tuán)標(biāo)記的正向引物和特異性編碼的反向引物；

和/或，所述特異性編碼的引物序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；

和/或，所述熒光基團(tuán)標(biāo)記的引物序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一種核酸捕獲探針微陣列，其特征在于包括呈陣列排布的多個(gè)第三探針和第四探針，所述第三探針和第四探針為編碼序列的互補(bǔ)序列捕獲探針，并且，所述第三探針的序列如SEQ ID NO.6所示，所述第四探針的序列如SEQ ID NO.7所示；優(yōu)選的，所述核酸捕獲探針微陣列還包括作為陰性參照的第一探針和作為陽性參照的第二探針，所述第一探針的序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二探針的序列如SEQ ID NO.5所示。

4.一種核酸快速擴(kuò)增和檢測的微流控芯片，其包括蓋片層和基片層，其特征在于：所述蓋片層和基片層之間閉合形成相連通的微流道和雜交反應(yīng)腔室，所述雜交反應(yīng)腔室內(nèi)固定設(shè)置權(quán)利要求3所述的核酸捕獲探針微陣列，并且，所述微流控芯片包括呈第一溫度的變性區(qū)域和呈第二溫度的退火延伸區(qū)域，或者，所述微流控芯片包括呈第一溫度的變性區(qū)域、呈第二溫度的退火區(qū)域及呈第三溫度的延伸區(qū)域，所述微流道貫穿連通于變性區(qū)域、退火延伸區(qū)域或變性區(qū)域與延伸區(qū)域中。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微流控芯片，其特征在于：所述變性區(qū)域與退火延伸區(qū)域或退火區(qū)域之間還設(shè)置有至少一個(gè)隔熱區(qū)域；優(yōu)選的，所述隔熱區(qū)域具有隔熱溝道，其設(shè)置于微流道背面；

和/或，所述雜交反應(yīng)腔室的溫度呈第四溫度，所述第四溫度為50～70℃；和/或，所述第一溫度為90～98℃；和/或，所述第二溫度為55～70℃；和/或，所述第三溫度為70～75℃；和/或，所述微流道包括蛇形溝道；

和/或，所述微流控芯片還包括廢液收集腔室，至少用以對擴(kuò)增產(chǎn)物和廢液進(jìn)行收集；

和/或，所述微流道的深度為0.05～1mm,寬度為0.1～2mm；

和/或，所述隔熱溝道的深度為0.5～4.5mm,寬度為1～5mm；

和/或，所述基片層的厚度為1～5mm，材質(zhì)包括聚碳酸酯和/或聚烯烴共聚物；

和/或，所述蓋片層的厚度為0.05～0.5mm，材質(zhì)包括聚碳酸酯和/或聚烯烴共聚物。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微流控芯片，其特征在于還包括依次層疊設(shè)置的導(dǎo)熱層、銅層和加熱膜層，所述微流道設(shè)置于導(dǎo)熱層上方；優(yōu)選的，所述銅層內(nèi)設(shè)置有溫度傳感器，至少用于測量溫度，并反饋給溫控電路實(shí)現(xiàn)精確溫控，優(yōu)選的，所述溫度傳感器包括熱電偶或者熱敏電阻。