[發明專利]一種制備新型溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L的方法

在審

• 申請號: 202110140305.2
• 申請日: 2021-02-01
• 公開（公告）號: CN112852757A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 吳俊華;魏繼武;張海林;張永輝;吳俊藝;劉淑雯;馬丁
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N5/10;C12N15/861;C12N15/47;C12R1/93
• 代理公司: 江蘇銀創律師事務所 32242
• 代理人: 何震花

1.一種離心擠壓剪切的類囊泡技術用于制備新型溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L的方法，其特征為步驟如下：

(1)制備細胞外膜上鑲嵌VSV-G蛋白的293T細胞，我們將此細胞命名為293T-VSV-G細胞，所述VSV-G蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:19所述，所述VSV-G蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:20所述；

(2)293T-VSV-G細胞過夜培養，然后向293T-VSV-G細胞接種腺病毒Ad5sPVRCD137L，繼續培養，然后收集細胞；腺病毒Ad5sPVRCD137L可以表達可溶性蛋白sPVRCD137L，該蛋白的一端是可以結合TIGIT的PVR蛋白，另一端是可以結合CD137的CD137L蛋白；

(3)使用培養基、PBS或者其他緩沖液重懸收集的感染腺病毒之后的293T-VSV-G細胞，將細胞懸液利用離心擠壓剪切的方法擠壓細胞剪切通過孔徑為10μm、5μm、1μm的膜濾紙；

(4)收集擠壓后的病毒懸液，將病毒懸液加入帶有15％、20％和40％碘克沙醇墊層的離心管中，100000×g離心一段時間，收集新型類囊泡病毒所在密度梯度帶；

(5)透析液透析去除雜質，獲得新型類囊泡病毒。

2.如權利要求1所述的一種類囊泡技術用于制備新型溶瘤病毒EM/VSV-GAd5sPVRCD137L的方法，其特征為：所述可溶性蛋白sPVRCD137L的DNA序列如SEQ ID NO:6所述，所述可溶性PVRCD137L的蛋白序列如SEQ ID NO:1所述；所述制備的新型溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L其內部為腺病毒Ad5sPVRCD137L，外面為類囊泡膜包裹層、且膜上有VSV-G蛋白。

3.如權利要求2所述的一種類囊泡技術用于制備新型溶瘤病毒EM/VSV-GAd5sPVRCD137L的方法，其特征為：所述可以結合TIGIT的PVR蛋白，在與TIGIT結合之后能阻斷PVR-TIGIT免疫檢測點通路；所述可以結合CD137的CD137L蛋白，在與CD137結合之后能活化CD137介導的免疫共刺激通路。