[發(fā)明專利]單增李斯特菌的微滴數(shù)字PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110139496.0
• 申請(qǐng)日: 2021-02-01
• 公開（公告）號(hào): CN112680535A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張紅星;謝遠(yuǎn)紅;章若曦;張帥;金君華;劉慧;劉文博
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/01
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 陳露

本發(fā)明提供了一種單增李斯特菌的微滴數(shù)字PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用，涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的單增李斯特菌的微滴數(shù)字PCR檢測(cè)方法，首先分別提取單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品和非目標(biāo)菌株的DNA，然后將得到的DNA進(jìn)行微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增得到反應(yīng)液，最后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè)和分析，其中微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增的探針具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，引物具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，該引物對(duì)單增李斯特菌的擴(kuò)增具有較好的特異性，能對(duì)食品中單增李斯特菌含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，周期短，靈敏度高、精密度高、穩(wěn)定性良好，且與大腸桿菌等均無交叉反應(yīng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種單增李斯特菌的微滴數(shù)字PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

微滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是新型核酸定量檢測(cè)技術(shù)，與傳統(tǒng)定量PCR(qPCR)技術(shù)不同，微滴數(shù)字PCR采用絕對(duì)定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，檢測(cè)極限可達(dá)單拷貝，具有比傳統(tǒng)RT-PCR更加出色的靈敏度、特異性和精確性。微滴數(shù)字PCR技術(shù)在痕量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面具有極大的優(yōu)勢(shì)。

單核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌(L.M)，屬于李斯特菌屬，是一種人畜共患病的致病菌。其引起的主要疾病包括細(xì)菌性腦膜炎、敗血癥、心肌炎、骨髓炎，甚至導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)以及新生兒感染。單增李斯特菌的主要特征之一是可在低溫下生長(zhǎng)，在零下20℃的環(huán)境下仍能存活1年，0～45℃都能生存，在冰箱冷藏室4～6℃的溫度下仍能大量繁殖，所以就有“冰箱殺手”的稱號(hào)。根據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(Centersfor Disease Control and Prevention，CDC)統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)平均每一年約有1600～2000例單增李斯特菌食物中毒事件發(fā)生，雖然該菌致病率并不是很高，但其致死率卻很高，對(duì)成年人的致死率高達(dá)20％～60％，而對(duì)新生兒則可達(dá)54％～90％。故而針對(duì)食品中單增李斯特菌的檢測(cè)對(duì)于保障食品安全是極為重要的。

目前常用檢測(cè)方法有傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)，包括EB增菌法和LB增菌法，通過微生物的分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、溶血試驗(yàn)、協(xié)同溶血試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)等，這些實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高，可操作性強(qiáng)，但檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，需6d-7d，這種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已無法滿足食品生產(chǎn)過程中的在線檢測(cè)、食品上市和消費(fèi)前的快速檢測(cè)的要求；傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法，如ELISA檢測(cè)方法，現(xiàn)在已有德國(guó)拜發(fā)公司生產(chǎn)的商品化的單增李斯特菌檢測(cè)試劑盒可供使用，用ELISA方法操作較簡(jiǎn)單，依賴抗體的品質(zhì)，特異性強(qiáng)，但檢測(cè)限相對(duì)較高，由于單克隆抗體制備昂貴，所以用ELISA試劑盒進(jìn)行多種食品樣品的檢測(cè)費(fèi)用較高；還有常用的RT-PCR方法，雖然具有靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，并且可定量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，但其定量依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)限尚不能檢測(cè)單拷貝并且對(duì)于操作要求高，容易產(chǎn)生假陽性和假陰性等問題。因此建立食品中單增李斯特菌的微滴數(shù)字PCR(ddPCR)檢測(cè)方法可以有效解決食品安全檢測(cè)中傳統(tǒng)方法的靈敏度不足、檢測(cè)精度不高、檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣等問題。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種單增李斯特菌的微滴數(shù)字PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短、檢測(cè)精度高、靈敏度好，能夠解決上述問題中的至少一種。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種單增李斯特菌的微滴數(shù)字PCR檢測(cè)方法在食品檢測(cè)中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，特采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種單增李斯特菌的微滴數(shù)字PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：分別提取單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品和非目標(biāo)菌株的DNA，然后將得到的DNA進(jìn)行微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增得到反應(yīng)液，最后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè)和分析；

所述微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增的引物具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；