[發(fā)明專(zhuān)利]牛種布魯氏菌A19株asd基因缺失株的構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110131146.X
• 申請(qǐng)日: 2021-01-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112852698B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉軍;紀(jì)雪;馮生;王鑫;朱镕年
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/90;A61K39/10;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 長(zhǎng)春眾邦菁華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

牛種布魯氏菌A19株asd基因缺失株的構(gòu)建方法和應(yīng)用，涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明的牛種布魯氏菌A19株asd基因缺失株的構(gòu)建方法包括以下步驟：步驟一、引物的設(shè)計(jì)與合成；步驟二、asd?kan融合基因的PCR擴(kuò)增；步驟三、pMD18?asd?kan缺失載體的構(gòu)建；步驟四、A19?Δasd缺失菌株的構(gòu)建。本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)定點(diǎn)敲除布魯氏菌A19菌株的asd基因，構(gòu)建了asd基因敲除營(yíng)養(yǎng)缺陷型布魯氏菌，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該牛種布魯氏菌A19株asd基因缺失株具有良好的安全性和免疫學(xué)特性，可作為預(yù)防布魯氏菌感染的候選疫苗菌株。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛種布魯氏菌A19株asd基因缺失株的構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種全世界廣泛流行且危害嚴(yán)重的人畜共患病。近些年來(lái)，布魯氏菌病的發(fā)生呈上升的趨勢(shì)。不但危害著公眾的健康，也極大地制約了畜牧業(yè)的發(fā)展。

使用疫苗免疫是防控布魯氏菌病的一項(xiàng)重要措施。目前市場(chǎng)上使用的布魯氏菌疫苗主要是活毒弱疫苗，如我國(guó)廣泛使用的布魯氏菌疫苗A19、M5、S2等，這些疫苗存在著安全性不好、副作用較強(qiáng)等缺陷，如A19疫苗株疫苗免疫后可能引起懷孕母畜流產(chǎn)，還會(huì)傳染人。而基因缺失疫苗具有毒力進(jìn)一步減弱、安全性高、遺傳背景清楚、免疫效果好而又不干擾診斷等特點(diǎn)，因此被科學(xué)家們廣泛關(guān)注。

天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶(aspartate L-semialdehyde dehydrogenase，ASD)為二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)生物合成途徑中的必需酶，DAP是革蘭氏陰性菌合成菌壁的重要化學(xué)成分。如果將編碼ASD的編碼基因(asd)敲除，在無(wú)外源DAP條件下，革蘭氏陰性菌不能形成完好的菌壁，而低滲溶菌死亡。

截至目前，還未見(jiàn)牛種布魯氏菌A19株asd基因缺失株的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種牛種布魯氏菌A19株asd基因缺失株的構(gòu)建方法和應(yīng)用，所構(gòu)建的asd基因缺失株具有良好的安全性和免疫學(xué)特性，可作為預(yù)防布魯氏菌感染的候選疫苗菌株。

本發(fā)明為解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的牛種布魯氏菌A19株asd基因缺失株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟一、引物的設(shè)計(jì)與合成；

步驟二、asd-kan融合基因的PCR擴(kuò)增；

步驟三、pMD18-asd-kan缺失載體的構(gòu)建；

步驟四、A19-Δasd缺失菌株的構(gòu)建。

作為優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟一的具體操作過(guò)程如下：

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中asd基因及其上下游序列設(shè)計(jì)引物，引物名稱及序列如下：

asdkan-N-F：5’-GGAGCCAAACCATGATGCAC-3’；

asdkan-N-R：5’-TTCGCTTGCTGTCCATAAAAATCAGATTGCAAAAGCGC CG-3’；

asdkan-C-F：5’-CTTGACGAGTTCTTCTGACAGGCCAAGGGAATCAGACC-3’；

asdkan-C-R：5’-GCAAAGATGACCTTGCGCTC-3’；

asdkan-F：5’-TTTTATGGACAGCAAGCGAA-3’；

asdkan-R：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAG-3’；

asd-I-F：5’-TAGAGCGGATCGACAAGCAG-3’；