[發(fā)明專利]一種重組類人膠原蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110128601.0
• 申請日: 2021-01-29
• 公開（公告）號: CN112745394B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖巧學;項琪;黃亞東;張齊
• 申請（專利權(quán)）人: 肽源（廣州）生物科技有限公司;廣州暨南大學醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A61L27/22;A61L27/54;A61K38/17;A61P17/02;A61K8/64;A61Q19/00;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

本發(fā)明公開了一種重組類人膠原蛋白(rhLEC)及其制備方法和應(yīng)用，所述蛋白具有溫敏特性，為類人源膠原蛋白(rhCOL)和彈性蛋白各自不同的功能域結(jié)合獲得的融合蛋白，包含彈性蛋白五肽重復(fù)序列Val?Pro?Gly?Xaa?Gly(VPGXG)n和類人膠原蛋白肽。所述融合蛋白可利用可逆相變循環(huán)法純化，實現(xiàn)融合蛋白的快速粗提及初步純化，減少工藝流程和純化成本。本發(fā)明的rhLEC相比于類人源膠原蛋白，顯著改善了其穩(wěn)定性。rhLEC顯著促進了細胞粘附和創(chuàng)傷修復(fù)，促進毛細血管生成和組織膠原新生。可作為組織工程基質(zhì)材料，細胞培養(yǎng)的活性添加劑，以及化妝品原料，具有較大的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種重組類人膠原蛋白(rhLEC)及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

重組類人膠原蛋白肽是一種生物性高分子物質(zhì)，具有水溶性強、生物活性高、無免疫源性低和生物相容性高的優(yōu)點。其常用于組織工程和創(chuàng)面敷料，有效提高皮膚再生速度，縮短創(chuàng)傷愈合時間。中國專利CN104098701A公開了一種重組類人膠原蛋白融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用，該融合蛋白熱穩(wěn)定性較差，常溫下容易降解，保存難度較大，且不易純化。因此亟需開發(fā)穩(wěn)定性好、易純化的重組類人膠原融合蛋白。

彈性蛋白是彈性纖維的主要成分，彈性纖維主要存在于韌帶和脈管壁，與膠原纖維共同存在，賦予組織以彈性和抗張能力。另外，彈性蛋白作為細胞外基質(zhì)的主要成分，起著一定的細胞間粘附和支持作用。人體皮膚衰老與真性彈性纖維被彈性蛋白酶降解有關(guān)。

五肽重復(fù)序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n是類彈性蛋白多肽基本序列單元，其中Xaa稱為客座殘基，是除了Pro以外的任意一種氨基酸。類彈性蛋白是仿照天然彈性蛋白氨基酸序列特性人工合成的蛋白質(zhì)，具有良好的細胞相容性、并能夠在體內(nèi)自然降解成氨基酸。另外，彈性蛋白來源于細胞外基質(zhì)，具有與彈性蛋白相似結(jié)構(gòu)的類彈性蛋白能向細胞組織提供相似的細胞外基質(zhì)環(huán)境。類彈性蛋白具有依賴于自身的序列、鹽度、溫度敏感性的可逆相變過程。基于ELP的可逆相變特性，使用ELP作為純化標簽純化蛋白的方法被稱為可逆相變循環(huán)法(ITC，Inverse Transition Cycling)法，ITC純化融合蛋白的方法是一種新型、發(fā)展?jié)摿Υ蟆?yīng)用前景廣的非色譜純化技術(shù)，而且具有回收率高、操作簡單、可對目標蛋白濃縮富集等優(yōu)勢。目前，也還未見有關(guān)于人源膠原蛋白和彈性蛋白融合的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷和不足，提供一種重組類人膠原蛋白(rhLEC)。

本發(fā)明的第二個目的在于提供所述重組類人膠原蛋白的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的在于提供所述重組類人膠原蛋白的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案給予實現(xiàn)的：

一種重組類人膠原蛋白(rhLEC)，包含五肽重復(fù)序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n和類人膠原蛋白肽(rhCOL，此類人膠原蛋白肽序列與中國專利CN104098701A中SEQ ID NO:1相同)。

本發(fā)明通過融合類人膠原蛋白肽和類彈性蛋白多肽各自不同的功能域得到上述rhLEC。所述融合蛋白可在大腸桿菌中進行可溶性表達，并通過逆相變循環(huán)法純化，解決了現(xiàn)有類人膠原蛋白肽蛋白粗提及純化步驟復(fù)雜、蛋白損耗大的問題。同時所述融合蛋白中類彈性蛋白能與水分子形成氫鍵，還可以與其他蛋白分子形成氫鍵增加融合蛋白的熱穩(wěn)定性，另外，本發(fā)明還意外發(fā)現(xiàn)所述rhLEC在促細胞粘附和創(chuàng)傷修復(fù)方面具有顯著效果。

優(yōu)選地，所述類人膠原蛋白肽的氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示。

優(yōu)選地，所述五肽重復(fù)序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n中Xaa為異亮氨酸，n＝40～60。