[發(fā)明專利]一種快速檢測單增李斯特菌的試劑盒及其制備方法和檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110107000.1
• 申請日: 2021-01-27
• 公開（公告）號: CN112553305A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賈利蓉;曾紅棱;鄧銳杰;任堯
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/06
• 代理公司: 成都中亞專利代理有限公司 51126
• 代理人: 趙婷;何淵

1.一種快速檢測單增李斯特菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括CRISPR-Cas檢測體系，具體包括：分子識別劑；信號轉(zhuǎn)換劑；轉(zhuǎn)錄體系；以及緩沖液；

其中，所述分子識別劑包括：Cas蛋白和L-crRNA ，L-crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述信號轉(zhuǎn)換試劑包括L-Broccoli和熒光染料，L-Broccoli的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；所述轉(zhuǎn)錄體系包括啟動子、phi29 DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、dNTPs、rNTPs、DNase I，啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖液包含10×phi 29聚合酶緩沖液和5×轉(zhuǎn)錄緩沖液；其中，所述10×phi 29聚合酶緩沖液的組成分為：33 mM Tris-醋酸鹽、10 mM醋酸鎂、66mM醋酸鉀、0.1％（v / v）吐溫 20、1 mM DTT；所述5×轉(zhuǎn)錄緩沖液的組分為200 mM Tris-HCl、30 mM MgCl₂、 50 mM DTT、50 mM NaCl 、 10 mM 亞精胺 。

3.一種制備如權(quán)利要求1或2所述的快速檢測單增李斯特菌的試劑盒的方法，其特征在于，該方法包含Broccoli適體的制備和crRNA的制備，所述Broccoli適體的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述Broccoli適體的制備方法包含：取5μL濃度為1～10 μM的 L-Broccoli、5 μL濃度為1～10 μM的啟動子以及5μL 10×phi29聚合酶緩沖液混勻，在80～90℃變性3～5分鐘，然后室溫反應(yīng)5～30分鐘；

再加入0.2～0.5 μL濃度為10 U / μL的 phi 29 DNA聚合酶和1～5 μL dNTPs，在30℃下孵育10～60min, 孵育使其延伸形成雙鏈；

再加入1～4 μL 濃度為20 U / μL 的T7 RNA聚合酶、5μL 5×轉(zhuǎn)錄緩沖液、2 μL rNTPs和水，37℃孵育1～6小時，轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，加入2μL DNase I孵育去除DNA模板，滅活后即得到Broccoli適體。

5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述crRNA的制備方法包含：取5μL濃度為1～10 μM 的L-crRNA、5 μL 濃度為1～10 μM 的啟動子以及5μL 10× phi 29聚合酶緩沖液混勻,80～90℃變性3～5分鐘，然后室溫反應(yīng)5～30分鐘；

再加入0.2～0.5 μL 濃度為10 U / μL 的phi 29 DNA聚合酶和1～5 μL dNTPs，30℃孵育10～60min, 孵育使其延伸形成雙鏈；

再加入10 μL 濃度為20 U / μL 的1～4 μL T7 RNA聚合酶、5μL 5×轉(zhuǎn)錄緩沖液，2 μLrNTPs和水，37℃孵育1～6小時，轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，加入2μL DNase I孵育去除DNA模板，然后滅活即得到crRNA適體。

6.一種采用如權(quán)利要求3～5任一所述的方法制備得到的快速檢測單增李斯特菌的試劑盒。

7.一種單增李斯特菌的的快速檢測方法，其特征在于，使用如權(quán)利要求1～2、6任一所述的試劑盒進行檢測，該檢測方法包含以下步驟：

（1）提取單增李斯特菌靶標(biāo)RNA：采用細(xì)菌總RNA分離試劑盒提取純化總RNA，并測定RNA濃度；

(2) 單增李斯特菌的檢測：將步驟（1）中的靶標(biāo)RNA，與Broccoli適體、熒光染料、crRNA和Cas蛋白混勻，孵育后檢測熒光；

（3）建立單增李斯特菌濃度與熒光強度的標(biāo)準(zhǔn)曲線:將不同濃度靶標(biāo)RNA，Broccoli、熒光染料、crRNA和和Cas蛋白混勻，孵育后檢測熒光，根據(jù)熒光結(jié)果繪制單增李斯特菌濃度與熒光強度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。