[發明專利]一株高產三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢桿菌

有效

• 申請號: 202110104985.2
• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN112662597B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 程代鳳;程招星
• 申請（專利權）人: 廬山市綠游生態農業開發有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/12;C12R1/07
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱雙;劉明星

本發明公開了一株高產三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢桿菌。本發明在一種農業害蟲桔小實蠅雄蟲的直腸中分離到一株可產生三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢桿菌RL3，將該菌采取改良的LB液體培養基進行發酵培養，發現該菌株可同時大量發酵生產三甲基吡嗪和四甲基吡嗪。本發明為生產三甲基吡嗪和四甲基吡嗪提供了生物發酵菌株和方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一株高產三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢桿菌。

背景技術

2,3,5-三甲基吡嗪(TMP)是一種具有烤花生香味的物質，存在于烘烤的可可豆、食醋、白酒中。常用作食品添加劑。另外白酒中的三甲基吡嗪還具有抗炎的作用。

2,3,5,6-四甲基吡嗪(TTMP)具有烘烤和堅果的特殊香味，天然存在于乳制品、豆制品、榛子、醋、面包、酒精類飲、咖啡和中藥等物質中。常用作食品添加劑，另外有研究表明，四甲基吡嗪在治療心腦血管疾病、呼吸系統疾病和腎小球疾病等方面具有一定療效。

近年來，隨著對TMP和TTMP的深入研究，這兩種物質的應用價值不斷被發掘。現有研究表明這兩種物質的合成方法主要有植物提取法、化學合成法、生物合成法。相比于植物提取法和化學合成法，生物合成法同時具有反應溫和、提取效率高、無污染等突出優點。1962年Kosuge等首次在發現枯草芽孢桿菌可發酵產生吡嗪類物質。現有研究證實了一些微生物發酵產生吡嗪類物質是兩步反應，首先是微生物以糖為底物產生乙偶姻，然后乙偶姻與氨基酸中的銨離子或者外源添加的銨離子結合生成吡嗪類的物質，在這個反應中菌種的類型、銨離子的含量和溫度都影響著吡嗪類物質的產量。因此，在實際應用中可以通過篩選優良菌株來提高吡嗪類物質的產量。

發明內容

本發明針對現有技術中微生物發酵法中生產三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的菌種發酵產物濃度低的問題，提供一株新分離的以葡萄糖和蘇氨酸為底物高產三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢桿菌，可以用此菌株發酵生產三甲基吡嗪和四甲基吡嗪。

因此，本發明的第一個目的是提供一株短小芽孢桿菌RL3，其保藏編號為GDMCCNO:61253。

本發明的短小芽孢桿菌RL3(Bacillus pumilus RL3)的形態特征為：在LB培養基上培養，呈白色蠟狀，形態為邊緣整齊、凸起、表面干燥、有皺褶。菌株形態為棒桿狀，長1.5-3.0微米，直徑0.6-0.7微米(圖1和圖2)。

分子生物學分類依據：

16S rRNA序列分析：提取菌RL3基因組DNA作為模板，以細菌16S rRNA通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT對DNA模板進行PCR擴增，PCR產物切膠回收后，用Sanger測序法進行序列測定。測序得到16S rRNA序列如SEQ IDNO.1所示，長度為1453bp。

將所得序列在NCBI數據庫中比對并下載同源序列，然后使用BLAST、MEGA等軟件建立系統發育樹(圖3)。將該序列在NCBI的NR數據庫進行Blast比對，表明其與芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)菌株的同源性最高，相似性大于99％，系統進化樹分析表明該菌株與Bacillus pumilus更接近，如圖3所示。結合菌落形態學特征和系統發育樹分析，明確該菌株為短小芽孢桿菌，將其命名為短小芽孢桿菌RL3(Bacillus pumilus RL3)。

本發明還提供所述的短小芽孢桿菌RL3(Bacillus pumilus RL3)在產吡嗪類化合物中的應用。

優選，所述的吡嗪類化合物為三甲基吡嗪和/或四甲基吡嗪。

本發明還提供一種三甲基吡嗪和/或四甲基吡嗪的制備方法，其是利用所述的短小芽孢桿菌RL3(Bacillus pumilus RL3)發酵制備得到的。