[發明專利]一種農桿菌介導桃遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 202110103367.6
• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN112695055A
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 蔡永萍;黃滿暢;周暉;張金云;潘海發;邱可立;盛玉;陳紅莉;謝慶梅
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 李靜

本發明涉及園藝作物基因工程領域，提供了一種農桿菌介導桃遺傳轉化方法，包括如下步驟：遺傳轉化受體建立，農桿菌的培養與侵染液的配置，侵染與共培養，除菌與篩選培養，抗性愈傷組織GUS染色鑒定。本發明以愈傷組織為受體，以GUS基因為報告基因，通過農桿菌GV3101介導的方法進行桃的遺傳轉化，獲得抗性愈傷組織，歷經數次繼代，經GUS染色確定為陽性愈傷組織。本發明方法可以顯著提升農桿菌介導轉化的成功率，同時此方法可以在桃基因工程、細胞工程、代謝工程以及桃遺傳轉化體系的建立中得到廣泛應用。

技術領域

本發明涉及園藝作物基因工程領域，尤其涉及一種農桿菌介導桃遺傳轉化方法。

背景技術

桃(Amygdalus persica L.)：薔薇科、桃屬植物，落葉小喬木。桃樹原產于中國，早在公元前十世紀已有記載。桃主要栽植在中國、日本等亞洲國家。其種類包括黃桃、水蜜桃、油桃、蟠桃等。

桃的童期較長，采用傳統的育種技術繁育需要花費較長的時間，這會大大增加勞動力成本，降低土地利用率。而利用基因工程進行種質改良，則可以解決這一問題，極大地縮短育種的時間。

分子生物學領域不斷進步和發展，果樹類園藝作物的遺傳轉化也在逐步完善。其中，桃的遺傳轉化起步相對較晚，直到1990年，R.SCORZA,P.H.MORGENS,J.M.CORDTS才用載體pGA472和根癌農桿菌A281獲得了轉基因愈傷組織。然而，此方法的轉化效率較低，已不能滿足當今需求。

據此，目前急需一種轉化率更高的農桿菌介導桃遺傳轉化方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種轉化率更高的農桿菌介導桃遺傳轉化方法。

本發明采用以下技術方案解決上述技術問題：

一種農桿菌介導桃遺傳轉化方法，包括如下步驟：

(1)遺傳轉化受體建立

以桃當年新鮮下胚軸為外植體，接種在愈傷組織誘導培養基表面；誘導出的愈傷組織歷經繼代即可作為遺傳轉化受體；

(2)農桿菌的培養與侵染液的配置

將帶有pSAK277-GUS質粒的農桿菌GV3101在LB固體培養基上劃線活化，挑選單菌落進行菌液PCR；將挑選出的單菌落搖菌14～18h，涂布培養；在液體愈傷分化培養基中添加0.02～0.03％乙酰丁香酮后，再加入上述菌懸浮培養2～3h，即為侵染液；

(3)侵染與共培養

將步驟(1)得到的愈傷組織浸泡在步驟(2)配置的侵染液中，在25～30℃、50～80r/min的條件下侵染10～20min；取出后用無菌紗布過濾，并用濾紙吸干多余水分；最后，將其接種在共培養培養基上，暗培養2.5～3.5天；

(4)除菌與篩選培養

將愈傷組織從共培養培養基中取出，用含400～500mg/L羧芐青霉素Carb的無菌水進行清洗；反復清洗2～3遍后，用無菌紗布濾紙吸除水分，再轉移到篩選培養基上培養；每20～30天進行一次篩選繼代，存活下來的即為抗性愈傷組織；

(5)抗性愈傷組織GUS染色鑒定

將步驟(4)篩選獲得的抗性愈傷組織分成兩份，其中一份用于GUS染色檢測，有特異性藍色顯色反應的愈傷組織即認定為陽性愈傷組織，表明桃遺傳轉化成功；另一份繼續用篩選培養基繼代，誘導不定芽。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(1)中，選擇花芽分化時期的桃下胚軸為外植體。