[發明專利]一種云霧貢茶CsPPO基因的克隆方法及其應用

在審

• 申請號: 202110102771.1
• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN112662686A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 王瑩;趙德剛;王濟紅;席培宇;向準;萬誠;李蕾嘉;李巖;趙丹;秦利軍
• 申請（專利權）人: 貴州大學;貴州省生物研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10;C12N15/84;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 王穎

1.一種云霧貢茶CsPPO基因的克隆方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

先提取云霧貢茶葉片總RNA后反轉錄為cDNA，以反轉錄的cDNA為模板，利用引物

PPO–Forward3：GGCACATCCCAAACAAAATA，

PPO-Reverse2:：CCGCTCGAGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA，

將擴增所得產物進行TA克隆系統的克隆以及測序后，選擇4號以及15號克隆作為模板進行分段擴增，分段擴增后再選取4號克隆PCR產物和15號克隆PCR產物作為模板進行融合PCR，得到云霧貢茶CsPPO基因。

2.根據權利要求1所述的克隆方法，其特征在于，

所述以4號克隆為模板進行分段擴增所用引物序列為：

PPO-Forward5:TGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAATTCTCTTCCACCATCAAGC，

PPO-Reverse3:AGCTTGGCAGTCTTACTACTCGA；

以15號克隆為模板進行分段擴增所用引物序列為：

PPO-Forward2：TCGAGTAGTAAGACTGCCAAGCT，

PPO-Reverse5：ATCATCATCTTTGTAATCCCCGGGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA。

3.根據權利要求3所述的克隆方法，其特征在于，所述融合PCR擴增反應中所用PCR引物為：

PPO-Forward5：TGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAATTCTCTTCCACCATCAAGC，

PPO-Reverse5：ATCATCATCTTTGTAATCCCCGGGGGAATCAAACTCAATATCGAGACCA。

4.一種云霧貢茶CsPPO基因在提高植物抗寒能力中的應用，其特征在于，將權利要求1所述云霧貢茶CsPPO基因的克隆方法克隆的得到的云霧貢茶CsPPO基因整合進入植物中構建轉基因植物，使得所述云霧貢茶CsPPO基因在轉基因植物中表達以提高植物的抗寒能力，所述云霧貢茶CsPPO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述構建轉基因植物包括以下步驟：

(1)構建含有云霧貢茶CsPPO基因的重組表達載體；

(2)對步驟(1)所構建的重組表達載體進行鑒定，確保云霧貢茶CsPPO基因存在于該表達載體中；

(3)將步驟(2)中鑒定正確的重組表達載體轉化至農桿菌GV3101中；

(4)通過步驟(3)獲得的含有重組表達載體的農桿菌侵染煙草植物，最終使云霧貢茶CsPPO基因在煙草植物中表達。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟(1)所述重組表達載體的構建方法為：

將云霧貢茶CsPPO基因與經XbaI和SmaI雙酶切的表達載體CaMV35S::E3-FLAG(PBI121)通過同源重組以及酶切連接方式構成重組表達載體。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述表達載體CaMV35S::E3-FLAG(PBI121)包括：Kan⁺抗性基因、多克隆位點、CaMV35S強啟動子以及3×FLAG標簽。

8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟(3)所述重組表達載體轉化至農桿菌GV3101的具體步驟為：

將重組表達載體加到含農桿菌GV3101的離心管中，先冰浴40min，再液氮冷凍1min以及37℃熱激5min處理后，將離心管加入500μL無抗生素LB液體培養基，于28℃搖床160rpm培養2h后將菌液涂布于含抗生素的LB固體培養基中，28℃，靜置2d篩選并進行PCR鑒定獲得重組工程菌。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述LB固體培養基中所含抗生素為卡那霉素、慶大霉素以及利福平。

10.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟(4)所述含有重組表達載體的農桿菌侵染植物的具體步驟為：

(1)制備無菌外植體；

(2)將含有重組表達載體的農桿菌進行擴繁，獲得菌液；

(3)將步驟(1)制備的外植體置于步驟(2)擴繁后的農桿菌菌液中，經共培養、芽誘導分化、生根以及抗性植株篩選后，最終獲得含云霧貢茶CsPPO基因的轉基因植株。