[發明專利]一株敲除Cln3基因的釀酒酵母基因工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110102085.4
• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN112779174B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 應漢杰;蔣穎;陳勇;趙偉;張濤;朱家慶;梁偲策;余斌
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/06;C12R1/865
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 肖明芳

1.一種利用敲除Cln3基因的釀酒酵母基因工程菌發酵制備乙醇的方法，其特征在于，該菌株由原始釀酒酵母的Cln3基因失活后改造得到，所述Cln3基因失活后的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述原始釀酒酵母來源于中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC?1308，通過固定化發酵制備乙醇。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所用Cln3基因通過CRISPR-Cas9敲除。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的釀酒酵母基因工程菌通過如下步驟構建得到：

（1）將Cas9質粒上gRNA?scaffold序列上的靶位點改為基因Cln3的靶位點，得到修改后的質粒；

（2）提取菌株保藏編號為CICC?1308的釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)的基因組；

（3）以步驟（2）得到的基因組DNA為模板，在Cln3基因的靶向序列的上下游各設置長度為500bp的同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以Cln3基因的上游同源臂、下游同源臂為模板，通過重疊PCR擴增得到基因敲除片段；

（4）將步驟（1）和（3）得到的修改后質粒和基因敲除片段轉化至原始釀酒酵母感受態中，即得Cln3基因失活的釀酒酵母基因工程菌。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化發酵以天然有機載體、人工合成高分子載體、人工無機高分子材料、復合材料作為固定化介質。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述發酵的溫度為30℃-40℃。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述發酵的發酵培養基配方如下：50-110g/L葡萄糖，3-6?g/L蛋白胨、0.3-0.6?g/L硫酸銨、2-5?g/L磷酸二氫鉀、2-5?g/L酵母膏、0.3-0.6?g/L硫酸鎂、0.01-1?g/L七水合硫酸亞鐵、0.01-1g/L七水合硫酸鋅，溶劑為水。