[發(fā)明專利]一種非天然核酸水凝膠及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110101329.7
• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN114790471B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳庭堅;張汝潔;彭樂麗;葉方開;雷謹(jǐn)銘;何傳平;王光遠(yuǎn)
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/6855;A61K47/54
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種非天然核酸水凝膠的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）上下游“毛刷”引物的制備：

a.?在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中摻入可配對的、堿基部分的5號位含炔丙胺基修飾的人工核苷酸5-propargylamino-dCTP，制備得到部分堿基上含氨基連接臂的核酸片段；所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中的聚合酶為Taq?DNA聚合酶、OneTaq?DNA聚合酶、Q5?DNA聚合酶或SFM4-3中的任意一種；

b.?將步驟a所得核酸片段與點擊化學(xué)接頭反應(yīng)，在核酸片段部分核苷酸上修飾接頭；

c.?根據(jù)目的片段的序列設(shè)計并合成上、下游引物，并將上、下游引物5'端修飾能與接頭發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)的疊氮基團；

d.?將步驟b所得部分核苷酸上含接頭的核酸片段，分別與步驟c所得5'端含修飾疊氮基團的上、下游引物進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)，得到上、下游“毛刷”引物；

（2）非天然核酸水凝膠的制備：

以含有目的片段的核酸片段或質(zhì)粒為模板，通過步驟（1）所得上、下游“毛刷”引物進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物濃縮后高溫退火，即得到所述的非天然核酸水凝膠；所述的PCR擴增的體系中含有0.8～1.2?mol/L?NaCl、0.04～0.06%?Tween20。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非天然核酸水凝膠的制備方法，其特征在于：

當(dāng)所述的聚合酶為SFM4-3時，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中摻入可配對的、堿基部分的5號位含炔丙胺基修飾的人工核苷酸時，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中摻入可配對的、糖基部分的2號位點上含氟基團修飾的人工核苷酸，制備得到堿基上含氨基修飾同時糖基上含氟基團修飾的核酸片段，再進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)；

和/或，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中摻入非天然堿基dTPT3和dNaM，制備得到含非天然堿基對的核酸片段，再進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)；

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中的核苷酸是脫氧核糖核苷酸混合物，或核糖核苷酸混合物，或脫氧核糖核苷酸/核糖核苷酸混合物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非天然核酸水凝膠的制備方法，其特征在于：

步驟b中所述的點擊化學(xué)接頭選自NHS-DBCO接頭或NHS-TCO接頭。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非天然核酸水凝膠的制備方法，其特征在于：

步驟a中所述的摻入的方式是完全替代或部分替代天然核苷酸中的一種或多種；

步驟a中所述的核酸片段的長度為50～100?bp。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非天然核酸水凝膠的制備方法，其特征在于：

步驟b中所述的核酸片段與點擊化學(xué)接頭的配比為摩爾比1:1000～1500；

步驟b中所述的反應(yīng)的條件為溫度35～40℃、時間10～15h；

步驟b中所述的反應(yīng)在pH=8.4～8.6的PBS緩沖液體系中進(jìn)行。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非天然核酸水凝膠的制備方法，其特征在于：

步驟d中所述的核酸片段與上下游引物的配比為摩爾比為8～12:1；

步驟d中所述的反應(yīng)的條件為溫度45～55℃、時間10～15?h；

步驟d中所述的反應(yīng)在pH=7.3～7.5的PBS緩沖液體系中進(jìn)行。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非天然核酸水凝膠的制備方法，其特征在于：

步驟（2）中所述的濃縮的條件如下：5000～7000?rpm轉(zhuǎn)速下離心25～35?min；

步驟（2）中所述的高溫退火的操作如下：在95℃加熱5min后逐漸冷卻至室溫。

8.一種非天然核酸水凝膠，其特征在于：通過權(quán)利要求1～7任一項所述的方法制備得到。

9.權(quán)利要求8所述的非天然核酸水凝膠在制備藥物載體中的應(yīng)用。