[發(fā)明專利]一種Flt3基因重組過表達質(zhì)粒及其在治療心肌缺血再灌注損傷中的應用

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• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112826933A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發(fā)明（設計）人: 蔣春英;徐亞偉;鄒艷;李雙;賈鵬
• 申請（專利權）人: 徐州市中心醫(yī)院;上海市第十人民醫(yī)院
• 主分類號: A61K45/00
• 分類號: A61K45/00;A61P9/10;C12N15/861;C12N15/54;C12N5/10
• 代理公司: 上海卓陽知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 巫蓓麗

本發(fā)明涉及一種Flt3基因重組過表達質(zhì)粒及其在治療心肌缺血再灌注損傷中的應用。本發(fā)明將序列如SEQ ID NO:1所示的Flt3基因片段插入到Adeasy014?pAdEasy?EF1?MCS?CMV?EGFP載體中，制備得到Flt3基因重組過表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染心肌細胞，驗證Flt3蛋白表達水平，結(jié)果表明所述Flt3基因重組過表達質(zhì)粒不僅成功表達Flt3蛋白，而且具有高效、靶向、長期穩(wěn)定表達的優(yōu)點，且證實Flt3過表達能有效預防心肌缺血再灌注損傷。本發(fā)明為研究Flt3的生物學作用和參與的信號通路，以及Flt3基因藥物和蛋白藥物的開發(fā)奠定了基礎，并拓寬了Flt3的用途。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體地說，涉及一種Flt3基因重組過表達質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應用。

背景技術

FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-1ike tyrosine kinase 3，F(xiàn)lt3)是Ⅲ型受體酪氨酸激酶(tyrosine kinase)受體家族的成員之一。在骨髓中主要表達在CD34⁺的造血干/祖細胞及樹突狀前體細胞上，在結(jié)構(gòu)上包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分，其胞外區(qū)有5個免疫球蛋白樣功能區(qū)，其中含有9個糖基化位點，跨膜區(qū)有不連續(xù)的激酶作用位點，胞內(nèi)區(qū)即酪氨酸酶催化域。當Flt3蛋白和配體發(fā)生特異性結(jié)合時，自身酪氨酸激酶被激活，與細胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)結(jié)合，催化其酪氨酸殘基磷酸化，從而發(fā)揮生物功能，在造血原始細胞的增殖、分化中有重要的作用。

Flt3蛋白參與機體內(nèi)多條信號通路。Flt3蛋白可促進Akt的表達和活化，通過Akt表達增加可抑制細胞凋亡，改善細胞功能。而且Akt表達增加可以上調(diào)VEGF的表達，從而促進血管新生。Flt3蛋白亦可不通過Akt信號途徑直接參與STAT5信號通路，是近年來發(fā)現(xiàn)的一條由細胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導通路，亦可直接參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學過程。期刊文獻(丁園藝,李艷,張蕊.FMS樣酪氨酸激酶3在惡性腫瘤中的研究進展[J].中國醫(yī)藥,2019(8).)指出Flt3改變在血液系統(tǒng)及非血液系統(tǒng)惡性腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)。血液系統(tǒng)疾病研究多集中于伴Flt3突變的急性髓系白血病，F(xiàn)lt3突變通過激活信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子5、蛋白激酶B等通路，促進白血病的發(fā)生發(fā)展。在實體腫瘤中也有研究發(fā)現(xiàn)Flt3存在一定作用，如Flt3表達在肝癌發(fā)生及侵襲過程起關鍵作用。Flt3可以成為腫瘤有前景的治療靶點。專利文獻CN111093640A指出Flt3抑制劑能夠增加阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用的功效，減少阿片類藥物的劑量。然而，目前未見Flt3在心肌細胞缺血再灌注損傷中的作用的報道，且現(xiàn)有技術相關問題是缺乏穩(wěn)定高效的Flt3基因轉(zhuǎn)染細胞株的直接有效方法。雖然文獻(郭瑤.FLT3激酶活性檢測方法的建立及其抑制劑的篩選[D].2013.)表達了正常型和突變型的FLT3催化結(jié)構(gòu)，由桿狀病毒轉(zhuǎn)染Sf9表達細胞系，但仍未解決上述技術問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種Flt3基因重組過表達質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和在治療心肌缺血再灌注損傷中的應用，旨在解決現(xiàn)有技術Flt3蛋白的表達水平低下、轉(zhuǎn)染細胞株不穩(wěn)定、生物學作用尚不完全清楚的問題。

第一方面，本發(fā)明提供了Flt3的上調(diào)劑在制備防治心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應用。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案，所述上調(diào)劑選自小分子化合物或生物大分子。

作為一個優(yōu)選例，所述生物大分子為轉(zhuǎn)入細胞后表達或過表達Flt3的表達載體或表達構(gòu)建物。

第二方面，本發(fā)明提供了一種Flt3基因重組過表達質(zhì)粒，所述Flt3基因重組過表達質(zhì)粒是將序列如SEQ ID NO:1所示的Flt3基因片段插入到Adeasy014-pAdEasy-EF1-MCS-CMV-EGFP載體中制備得到的。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案，所述Flt3基因片段插入在Adeasy014-pAdEasy-EF1-MCS-CMV-EGFP載體的Kpa I和Xho I位點之間。