[發明專利]無血清干細胞培養基及其應用

在審

• 申請號: 202110096731.0
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112662623A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 關方霞;馮娟;崔南征;郭軍輝
• 申請（專利權）人: 中科博生生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務所(普通合伙) 32260
• 代理人: 郭鴻賓

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及無血清干細胞培養基，在基礎培養中添加12?25mg/mL聚乳酸營養微球、1?10μg/mL谷胱甘肽、1?4mM L?谷氨酰胺、濃度40?60μMβ?巰基乙醇、0.01?1mmol/L維A酸和1?10v/v％非必需氨基酸。本發明還將將上述無血清干細胞培養基用于培養干細胞。本發明提供的無血清干細胞培養基不含動物來源血清，批次間穩定無干擾，有利于產物的分離純化，縮短適應期，具有更好的細胞增殖速率，使細胞的干性、增殖能力和生理代謝活動能維持更好對抗細胞衰老和凋亡。

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及無血清干細胞培養基及其應用。

背景技術

干細胞及其代表的再生醫學領域研究近二十年來不斷取得重大技術突破，引發了人們對干細胞技術產業化及臨床應用的高度重視。截止到2019年，全球已有16款干細胞產品上市，其中間充干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)由于具有多種優點而成為產品最多，發展最為迅猛的干細胞類型。間充質干細胞來源于發育早期的中胚層，是一類非造血干細胞，其廣泛存在于骨髓、皮下脂肪、骨外膜、肌肉、滑膜、滑液、肝臟、外周組織、臍帶、臍帶血及胎盤等組織。干細胞培養使用有血清培養基或無血清培養基。血清培養基大都含有動物血清，血清的成分復雜如最為常見的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，血清批間差異、成本高等問題，越來越多的科學家通過研究手段確定配細胞生長所需的營養物質成分，并通過試驗確定了可以促進細胞生長時這些營養物質在培養基中的最低含量，從而豐富了人們對無血清培養基的認識。無血清培養基一般由基礎培養基和替代血清的添加劑兩部分組成。基礎培養基通常由葡萄糖、氨基酸、無機鹽和維生素等按一定比例的組合而成；而添加劑替代了傳統培養基中的血清，既能有效避免血清帶來的諸多問題，也能滿足動物細胞培養的要求。現有技術中的無血清培養基細胞增殖率低，且極易分化或、易引起成體干細胞衰老和凋亡，嚴重影響了干細胞的數量和質量。

發明內容

針對上述現有技術的不足，本發明提供了無血清干細胞培養基，目的是為了解決現有技術中的無血清培養基細胞增殖率低，且極易分化或、易引起成體干細胞衰老和凋亡，嚴重影響了干細胞的數量和質量的技術問題。

本發明提供的無血清干細胞培養基，具體技術方案如下：

無血清干細胞培養基，在基礎培養中添加12-25mg/mL聚乳酸營養微球、1-10μg/mL谷胱甘肽、1-4mM L-谷氨酰胺、濃度40-60μMβ-巰基乙醇、0.01-1mmol/L維A酸和1-10v/v％非必需氨基酸。

某些實施方式中，所述聚乳酸營養微球的制備方法如下：

將聚乳酸溶于二氯甲烷形成聚乳酸溶液；并將胰島素、轉鐵蛋白、BMP-4、FGF-2和細胞生長因子添加進入聚乳酸溶液中形成復合營養液，將所述復合營養液噴霧至60-70℃的水中后進行干燥處理，獲得聚乳酸營養微球。

某些實施方式中，胰島素、轉鐵蛋白、BMP-4、FGF-2、細胞生長因子和聚乳酸的質量比為0.1-0.5)：(0.01-0.05)：(0.01-0.05)：(0.01-0.05)：(0.3-0.7)：1。

某些實施方式中，所述基礎培養基為DEME培養基。

某些實施方式中，所述非必須氨基酸由谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸組成。

無血清干細胞培養基的應用，將上述無血清干細胞培養基用于培養干細胞。

某些實施方式中，所述干細胞的培養的條件為5％CO₂、37℃，密度接種為(0.1-10)×10⁵個/mL。