[發明專利]一種利用磁性納米粒子固定化細胞酶解魷魚內臟制備ACE抑制肽的方法

有效

• 申請號: 202110096303.8
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112795561B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 李云;周飛;朱慧
• 申請（專利權）人: 韓山師范學院
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12P21/06;C07K1/34;C12R1/125
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 彭妙玲;周增元

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種采用聚乙烯亞胺(PEI)修飾二氧化硅包裹的四氧化三鐵(Fe₃O₄)磁性納米微球，利用該納米微球固定化枯草芽孢桿菌細胞酶解魷魚內臟下腳料制備ACE抑制肽的方法，該方法的步驟包括：制備魷魚內臟提取物干粉、磁性納米微球的制備、菌株活化與培養、細胞固定化、酶解與分離、超濾和干燥。本發明的方法酶解效率高，酶解產物容易分離。固定化的細胞重復利用多次仍能達到好的蛋白水解度和ACE抑制活性，降低了方法的成分。所制備的多肽產物具有良好的ACE抑制活性，IC₅₀值達0.109mg/mL。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體為利用磁性納米粒子固定化細胞酶解魷魚內臟制備ACE抑制肽的方法。

背景技術

魷魚內臟是魷魚加工的主要副產物，占魷魚鮮重的20％以上。魷魚內臟下腳料水分含量高，組織酶活躍，很難儲藏，加工后大部分被直接丟棄，或僅被簡單加工成養殖用的飼料，不僅污染環境，還造成了資源的浪費。魷魚內臟是一類蛋白豐富的生物資源，含有豐富的蛋白質等營養成分，并且這些蛋白大多為容易降解的水溶性蛋白，因此魷魚內臟是制備生物活性肽的良好原料。目前，利用魷魚內臟下腳料制備生物活性肽主要有三種方法：酶解法、微生物發酵法和組織酶自溶法。酶解法是通過添加外源蛋白酶降解原料中的可溶性蛋白質釋放生物活性肽(食品科技,2011,36(03):116-119，中國農學通報,2015,31(20):39-43)，但是添加外源屬于一次性使用，無法回收再利用，使得成本較高，限制了這種方法在大規模制備上的應用。微生物發酵法是接種產蛋白酶和肽酶的微生物到原料液或在原料配制液中進行發酵，利用菌體產的蛋白酶和肽酶降解原料蛋白而獲得活性肽(浙江海洋大學學報,2018,37(01):50-54)。發酵法具有水解效率高、成本低的優點，但是發酵的時間和周期較長，增加了工藝的復雜度。自溶水解法是利用魷魚內臟自身存在的組織蛋白酶對蛋白進行水解而釋放活性肽(食品科學,2017,38(01):238-243)，該方法無需添加蛋白酶，成本低廉，但由于組織酶酶解性質不穩定，同時廢棄物中常含有雜的微生物，在酶解過程中容易滋生，導致酶解產物不穩定，蛋白水解的效率低。

固定化細胞酶解是將高產蛋白酶的微生物細胞固定在支持介質上，在酶解過程中利用菌體細胞不斷產生的蛋白水解酶水解底物蛋白，獲得有生物活性的多肽序列。固定化細胞酶解不使用純酶，而且菌體固定在介質上容易和上清液分離，并可以反復多次使用，極大地降低了過程操作的成本。此外，菌體細胞固定化以后能保護細胞免受劇烈攪拌等惡劣環境的影響，細胞的穩定性好，產酶的活力也得到了提高。目前，已有利用海藻酸鈉、聚乙二醇和殼聚糖等材料通過包埋固定枯草芽孢桿菌細胞，酶解乳清蛋白制備ACE抑制肽和抗氧化肽的報道(International Journal of Peptide Research and Therapeutics,25(2),681-689.)。然而，傳統的固定化方法如包埋法，存在包埋后傳質的阻力大，特別是酶分泌到反應液中傳質阻力大，介質可以負載的細胞生物量小，穩定性差，細胞與介質的結合易受到環境的影響等確定，限制了固定化技術在實際中的應用。

發明內容

本發明的目的在于，解決現有用酶解法制備魷魚內臟廢棄物ACE抑制肽的技術中，采用添加外源酶酶解成本高，采用發酵法周期長、工藝復雜度高，組織酶自溶法操作穩定性不好等缺點。本發明開發了一種采用磁性納米微球固定化菌種，酶解制備ACE抑制肽的方法，較傳統的細胞固定化方法酶解效率更好，產物活性更高。

為了解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種利用磁性納米粒子固定化細胞酶解魷魚內臟制備ACE抑制肽的方法，包括如下步驟：

A、原料的預處理：魷魚內臟與去離子水混合加熱，去除塊狀魚骨，絞碎、干燥、粉碎，獲得魷魚內臟提取物細粉；