[發(fā)明專利]一種混合菌種固態(tài)發(fā)酵蝦頭制備ACE抑制肽的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110095953.0 | 申請日： | 2021-01-25 |
| 公開（公告）號： | CN112852909B | 公開（公告）日： | 2023-05-09 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 朱慧;李云;周飛 | 申請（專利權(quán)）人： | 韓山師范學(xué)院 |
| 主分類號： | C12P21/06 | 分類號： | C12P21/06;C12R1/125;C12R1/10 |
| 代理公司： | 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202 | 代理人： | 彭妙玲;周增元 |
| 地址： | 521000*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 混合 菌種 固態(tài) 發(fā)酵 制備 ace 抑制 方法 | ||
1.一種混合菌種固態(tài)發(fā)酵蝦頭制備ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步驟：
A、原料的預(yù)處理：將新鮮蝦頭干燥、粉碎，獲得破碎后蝦頭粉；
B、菌株活化：取枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別進(jìn)行固體斜面活化培養(yǎng)，獲得斜面培養(yǎng)物；
C、種子液的準(zhǔn)備：將所述斜面培養(yǎng)物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)整菌體濃度為1~50×107?CFU/mL，分別獲得枯草芽孢桿菌種子液和地衣芽孢桿菌種子液，所述枯草芽孢桿菌種子液和所述地衣芽孢桿菌種子液按體積比1:0.5~3比例混合，獲得種子液；
D、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備、拌料與滅菌：所述破碎后蝦頭粉按每100g與30~80mL培養(yǎng)液混合，混勻后用0.5~0.6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0~8.0，于121~125℃下滅菌15~20min，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基；
E、接種與固態(tài)發(fā)酵：將所述種子液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基混合，按每100g蝦頭粉接種5~20mL所述種子液，在28~40℃、相對濕度60~100%條件下固態(tài)發(fā)酵，從發(fā)酵時間24~36小時開始，每12~24小時按每100g蝦頭粉加入滅菌后的20~25g/L葡萄糖溶液10~50mL，發(fā)酵至4~7天結(jié)束，獲得發(fā)酵物料；
F、肽的提取和分離：將所述發(fā)酵物料與酸劑混合，攪拌后經(jīng)過濾、脫色、超濾，超濾步驟為采用5?kDa的陶瓷膜進(jìn)行超濾，保留分子量小于5?kDa的組分，再采用1?kDa的陶瓷膜進(jìn)行第二次超濾，保留分子量小于1?kDa的組分，合并收集小于1kDa的濾液上樣，進(jìn)行洗脫去雜，獲得含ACE抑制肽的洗脫液；
G、濃縮、干燥制成成品：將所述洗脫液濃縮、干燥，獲得含ACE抑制肽的蝦頭發(fā)酵多肽粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述混合菌種固態(tài)發(fā)酵蝦頭制備ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步驟：
A、原料的預(yù)處理：將所述新鮮蝦頭于60~70℃烘箱中干燥18~20小時至恒重，之后采用粉碎機(jī)破碎，過8~80目標(biāo)準(zhǔn)篩，獲得所述破碎后蝦頭粉，顆粒粒徑為0.2~2.5mm；
B、菌株活化：取所述枯草芽孢桿菌和所述地衣芽孢桿菌分別接種于斜面培養(yǎng)基，37~40℃培養(yǎng)18~24小時，分別獲得枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)物和地衣芽孢桿菌斜面培養(yǎng)物；
C、種子液的準(zhǔn)備：將所述枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)物和所述地衣芽孢桿菌斜面培養(yǎng)物分別接種于種子液培養(yǎng)基，在37~40℃、200~300rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)18~30小時，之后加入適量無菌種子液培養(yǎng)基稀釋，分別獲得所述枯草芽孢桿菌種子液和所述地衣芽孢桿菌種子液，所述枯草芽孢桿菌種子液和所述地衣芽孢桿菌種子液混合獲得所述種子液；
D、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備、拌料與滅菌：所述破碎后蝦頭粉按每100g與30~80mL所述培養(yǎng)液混合，混勻后用0.5~0.6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0~8.0，于121~125℃下滅菌15~20min，獲得所述發(fā)酵培養(yǎng)基；
E、接種與固態(tài)發(fā)酵：將所述種子液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基混合，按每100g蝦頭粉接種5~20mL所述種子液，在28~40℃、相對濕度60~100%條件下發(fā)酵，從發(fā)酵時間24~36小時開始，每12~24小時按每100g蝦頭粉加入滅菌后的20~25g/L葡萄糖溶液10~50mL，發(fā)酵至4~7天結(jié)束，獲得所述發(fā)酵物料；
F、肽的提取和分離：將所述發(fā)酵物料按每100g與200~500mL?濃度為0.05~0.08mol/L鹽酸溶液混合，在150~200rpm攪拌、10~30℃條件下提取1~2小時，提取液經(jīng)200~300目的濾布過濾后得到初濾液，按所述初濾液體積的0.3~0.5%加入活性碳，40~45℃吸附30~60分鐘后再次過濾，之后采用5?kDa的陶瓷膜進(jìn)行超濾，保留分子量小于5?kDa的組分，再采用1kDa的陶瓷膜進(jìn)行第二次超濾，保留分子量小于1?kDa的組分，合并收集小于1kDa的濾液上樣于陽離子交換柱，待小肽完全吸附于柱上后，采用去離子水清洗柱子以去除非肽類雜質(zhì)，然后用1~2mol/L?氨水洗脫吸附在所述陽離子交換柱上的多肽，收集獲得含ACE抑制肽的洗脫液；
G、濃縮、干燥制成成品：將所述洗脫液經(jīng)低溫真空濃縮、冷凍干燥，獲得含ACE抑制肽的蝦頭發(fā)酵多肽粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述混合菌種固態(tài)發(fā)酵蝦頭制備ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌CMCC63501，所述地衣芽孢桿菌菌株為地衣芽孢桿菌AS1.269。
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