[發(fā)明專利]一種用于成熟植物的基因編輯系統(tǒng)及基因編輯方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110095351.5
• 申請(qǐng)日: 2021-01-25
• 公開（公告）號(hào): CN112877368B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓鶴友;李爍鈞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/89
• 分類號(hào): C12N15/89
• 代理公司: 北京隆源天恒知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11473
• 代理人: 吳航

1.一種用于成熟植物的基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，包括CNT載體和負(fù)載在所述CNT載體上的核酸分子，所述核酸分子為CRISPR/Cas9?IVTs；

其中，所述CNT載體為以羧基化CNT為骨架、表面鍵合聚乙烯亞胺的改性CNT載體；

所述改性CNT載體的制備方法，包括以下步驟：

S11、將羧基化CNT加入到MES?buffer中并調(diào)節(jié)pH至4.5-5，超聲分散，離心去除聚集的管束，得到CNT分散液；

S12、向所述CNT分散液中加入EDC和NHS，室溫下攪拌反應(yīng)，離心去除游離的EDC和NHS，得到活化的CNT分散液，之后加入為羧基化CNT?15-20倍質(zhì)量的精氨酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，分離得到精氨酸修飾的CNT；

S13、將所述精氨酸修飾的CNT加入MES?buffer中并調(diào)節(jié)pH至4.5-5，超聲分散，加入EDC和NHS，室溫下攪拌反應(yīng)，離心去除游離的EDC和NHS，得到活化的精氨酸修飾的CNT分散液，之后加入為羧基化CNT?8-12倍質(zhì)量的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，得到改性CNT粗液，將所述改性CNT粗液置換至RNase-free?Water的環(huán)境中，再次超聲分散，離心去除聚集的管束，分離得到改性CNT載體；

其中，步驟S12和步驟S13中，所述羧基化CNT、所述EDC、所述NHS以質(zhì)量比計(jì)為羧基化CNT：EDC：NHS=2：1：1；

所述改性CNT載體與所述核酸分子的質(zhì)量比為1：1或1：2；

所述MES?buffer為2-（N-嗎啉）乙磺酸緩沖液，所述EDC為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺，所述NHS為N-羥基琥珀酰亞胺。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于成熟植物的基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述改性CNT載體為改性單壁CNT載體或改性多壁CNT。

3.?一種基因編輯方法，其特征在于，包括以下步驟：將如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的植物基因編輯系統(tǒng)的CNT載體與核酸分子加入到MES?delivery?buffer中，混合均勻，靜置，吸取底部100-200μL混合液注射進(jìn)煙草葉片中，之后置于溫室培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因編輯方法，其特征在于，所述混合液中CNT載體的濃度為30-50ng/μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因編輯方法，其特征在于，所述混合液中CNT載體與核酸分子的質(zhì)量比為1：1。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因編輯方法，其特征在于，所述煙草葉片為成熟的葉片或離體培養(yǎng)的葉片的懸浮細(xì)胞。