[發明專利]一種鞍帶石斑魚頭腎細胞系及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110088381.3
• 申請日: 2021-01-22
• 公開（公告）號: CN112941011B
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發明（設計）人: 黃友華;黃曉紅;劉澤天;秦啟偉
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了一種鞍帶石斑魚頭腎細胞系及其構建方法和應用。ELHK細胞系于2020年12月04日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，地址：廣東省廣州市越秀區先烈中路100號59號樓5樓，郵編：510070，保藏號為：GDMCC?No：61340。本發明獲得了鞍帶石斑魚頭腎細胞系?ELHK細胞系，其生長狀態良好，細胞增殖穩定、細胞形態以成纖維樣為主要形態，不僅可以連續傳代(目前細胞已經傳至超過120代)，并可超低溫凍存和復蘇，該細胞系的建立為石斑魚種質資源保存的相關研究奠定基礎。

技術領域：

本發明屬于海水魚類細胞培養技術領域，具體涉及一種鞍帶石斑魚頭腎細胞系及其構建方法和應用。

背景技術：

石斑魚(Epinephelus?sp.)屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、鰭科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinate)，是暖水性底棲魚類，是我國南方和東南亞國家主要的經濟養殖海水魚類。鞍帶石斑魚(Epinepheluslanceolatus)是近些年在我國廣東、福建等南方沿海地區引進的石斑魚養殖品種，具有肉味鮮美、營養價值高、生長速度快、適應性強等優點。而且作為父本與老虎斑雜交后培育出的珍珠鞍帶石斑魚，目前養殖量已占據海南石斑魚養殖總量的70％。然而，隨著石斑魚養殖規模的擴大，品種單一化、養殖集約化程度提高及養殖環境惡化等問題，由細菌性、病毒性或寄生蟲等病原引起的疾病日益頻繁爆發，對石斑魚養殖造成重大經濟損失。病害問題已經逐漸成為制約石斑魚養殖產業健康發展的主要瓶頸。

虹彩病毒和神經壞死癥病毒是石斑魚病毒性疾病的主要的兩種病原，研究病毒感染致病機理、病毒與宿主細胞相互作用將為闡明病原特性提供重要的理論信息，而研制高效的疫苗能為預防和解決石斑魚病毒性疾病提供有效策略。魚類細胞系作為一種體外培養系統，最初主要應用于病毒的分離鑒定、病毒純化及病毒疫苗的制備。但因其成本低、重復性好，條件可控等諸多優點，魚類細胞系的應用也日趨廣泛，逐漸應用于魚類病毒分子生物學、免疫學、毒理學、遺傳發育生物學及疫苗學研究領域。至今，盡管已經建立200多種用于病毒分離鑒定和病毒學研究的魚類細胞系，但來源于淡水魚類的細胞系對多數海水魚類病毒不敏感。故建立對不同病毒敏感的海水魚類細胞系成為海水魚類病毒病研究和防控的迫切需要。

迄今為止，針對海水魚虹彩病毒分離增殖的合適細胞系不多，特別是神經壞死癥病毒。另外，在研究病毒-宿主互作的過程中，宿主細胞免疫反應也是研究的熱點和重點。魚類頭腎是巨噬細胞、顆粒細胞、B淋巴細胞等免疫細胞發育、分化和增殖的重要場所，也是捕獲抗原和產生抗體的主要器官，在魚類免疫中起著重要作用。故頭腎細胞是研究病毒-宿主間免疫相互調節作用的首選細胞系。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供一種生長狀態良好，細胞增殖穩定不僅可以連續傳代，并可超低溫凍存和復蘇，且沒有支原體污染，可用于體外表達基因以及病毒感染分離等研究的鞍帶石斑魚頭腎細胞系(Epinephelus?lanceolatus?head?kidney?cell)，以下簡稱ELHK細胞系，其于2020年12月04日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，地址：廣東省廣州市越秀區先烈中路100號59號樓5樓，郵編：510070，保藏號為：GDMCC?No：61340。

本發明的第二個目的是提供ELHK細胞系在表達外源基因中的應用。

本發明的第三個目的是提供ELHK細胞系作為病毒感染的宿主細胞在研究病毒感染或病毒誘導免疫反應中的應用。

所述的病毒是新加坡石斑魚虹彩病毒(SGIV)或赤點石斑魚神經壞死病毒(RGNNV)。

本發明的第四個目的是提供一種ELHK細胞系的構建方法，其包括以下步驟：

(1)原代培養：將鞍帶石斑魚頭腎組織進行胰酶消化獲得細胞懸浮液，加入原代細胞培養液培養獲得原代細胞；

(2)傳代培養：將原代細胞接種到傳代細胞培養液進行傳代培養；