[發(fā)明專(zhuān)利]零模波導(dǎo)孔結(jié)構(gòu)及其制備方法、以及其使用方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110086220.0
• 申請(qǐng)日: 2021-01-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112680320A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭振;俞鵬飛;周連群;鄭文彥;張芷齊;李傳宇;李超;李金澤;張威;李樹(shù)力
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 季華實(shí)驗(yàn)室
• 主分類(lèi)號(hào): C12M1/00
• 分類(lèi)號(hào): C12M1/00;C12M1/34;C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳市世紀(jì)恒程知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 44287
• 代理人: 薛福玲

本發(fā)明公開(kāi)一種零模波導(dǎo)孔結(jié)構(gòu)及其制備方法、以及其使用方法，其中，所述零模波導(dǎo)孔結(jié)構(gòu)包括襯底和第一金屬覆蓋層，所述襯底的上側(cè)面設(shè)有第一納米孔，所述第一金屬覆蓋層設(shè)于所述襯底上，所述第一金屬覆蓋層設(shè)有上下貫通的第二納米孔，所述第二納米孔對(duì)應(yīng)所述第一納米孔設(shè)置且與所述第一納米孔連通，其中，所述第二納米孔的孔徑大于所述第一納米孔的孔徑。如此，通過(guò)選擇照射零模波導(dǎo)孔的光線的波長(zhǎng)，即可使光線可穿透第二納米孔，但無(wú)法穿透第一納米孔，從而使第一納米孔內(nèi)的DNA聚合酶保持活性，而第一納米孔外的DNA聚合酶失活，進(jìn)而提高了DNA聚合酶的單分子占有率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及單分子DNA測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種零模波導(dǎo)孔結(jié)構(gòu)及其制備方法、以及其使用方法。

背景技術(shù)

單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)的兩個(gè)主要技術(shù)是(1)零模波導(dǎo)(ZMW)限制允許在與酶相關(guān)的標(biāo)記核苷酸濃度下進(jìn)行單分子檢測(cè)，(2)熒光標(biāo)記的磷酸連接核苷酸，允許觀察不間斷的DNA聚合。

ZMW孔是一種直徑只有幾十個(gè)納米的孔，光線進(jìn)入ZMW后呈指數(shù)衰減，由于其底部上的小孔短于激光的單個(gè)波長(zhǎng)，導(dǎo)致激光無(wú)法直接穿過(guò)小孔，而會(huì)在小孔處發(fā)生光的衍射，形成局部發(fā)光的區(qū)域，即為熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)，該區(qū)域內(nèi)錨定有DNA聚合酶。測(cè)序時(shí)將基因組的DNA打斷成許多小的片段，制成液滴后將其分散到不同的ZMW孔中。當(dāng)ZMW孔底部聚合反應(yīng)發(fā)生時(shí)，被不同熒光標(biāo)記的核苷酸會(huì)在小孔的熒光探測(cè)區(qū)域中被聚合酶滯留數(shù)十毫秒，熒光標(biāo)記會(huì)在激光束(Excitation)的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類(lèi)就可以判定dNTP的種類(lèi)，反應(yīng)完成后熒光標(biāo)記會(huì)被聚合酶切除而彌散出ZMW小孔，其它未參與合成的dNTP由于沒(méi)進(jìn)入熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)而不進(jìn)入熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)。

為了使測(cè)序反應(yīng)正常進(jìn)行，需要將待測(cè)DNA、DNA聚合酶、引物錨定在ZMW孔底部，為了分析過(guò)程的方便，每個(gè)ZMW孔底部只能錨定一個(gè)DNA聚合酶，進(jìn)行一個(gè)測(cè)序反應(yīng)，目前提出的方案有化學(xué)藥品選擇性修飾、氧化法等，但目前這些方案存在ZMW孔內(nèi)的DNA聚合酶單分子占有率低的問(wèn)題，從而導(dǎo)致了無(wú)效孔較多，造成浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的是提出一種零模波導(dǎo)孔結(jié)構(gòu)及其制備方法、以及其使用方法，旨在解決現(xiàn)有零模波導(dǎo)孔內(nèi)的聚合酶單分子占有率低的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種零模波導(dǎo)孔結(jié)構(gòu)，包括：

襯底，所述襯底的上側(cè)面設(shè)有第一納米孔；以及，

第一金屬覆蓋層，設(shè)于所述襯底上，所述第一金屬覆蓋層設(shè)有上下貫通的第二納米孔，所述第二納米孔對(duì)應(yīng)所述第一納米孔設(shè)置且與所述第一納米孔連通；

其中，所述第二納米孔的孔徑大于所述第一納米孔的孔徑。

可選地，所述零模波導(dǎo)孔結(jié)構(gòu)還包括第二金屬覆蓋層，所述第二金屬覆蓋層設(shè)于所述第一金屬覆蓋層之上，所述第二金屬覆蓋層設(shè)有上下貫通的第三納米孔，所述第三納米孔與所述第二納米孔對(duì)應(yīng)設(shè)置且連通；

所述第一納米孔的孔壁上設(shè)有第一感光激活層，所述第二納米孔的孔壁上設(shè)有第二感光激活層，所述第三納米孔的孔壁上設(shè)有第三感光激活層；

所述第三納米孔的孔徑大于所述第二納米孔的孔徑大于所述第一納米孔的孔徑。

可選地，所述第一納米孔的底壁設(shè)有用以連接DNA聚合酶的連接部。

可選地，所述連接部的材質(zhì)包括經(jīng)硅烷功能化后的聚乙二醇，且所述聚乙二醇上連接有鏈霉親和素。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提出一種零模波導(dǎo)孔結(jié)構(gòu)的制備方法，包括以下步驟：

S10、提供襯底，在所述襯底的上側(cè)面開(kāi)設(shè)第一納米孔；

S20、在所述襯底的上側(cè)面上形成第一金屬覆蓋層，在所述第一金屬覆蓋層上開(kāi)設(shè)與所述第一納米孔連通的第二納米孔，且所述第二納米孔的孔徑大于所述第一納米孔；