[發(fā)明專利]一種交替糖蔗糖酶表達及其制備交替糖的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110086152.8
• 申請日: 2021-01-22
• 公開（公告）號: CN112852842B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發(fā)明（設計）人: 吳丹;鄭璞;程鵬程;戴悅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/81;C12N1/19;C12N9/10;C12P19/00;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開了一種交替糖蔗糖酶表達及其制備交替糖的方法，屬于酶工程技術領域。構建的畢赤酵母工程菌(Pichia?pastoris?X33/pPICZa?ASR)，經(jīng)3L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，所產交替糖蔗糖酶酶活達到34.5U/mL以上，實現(xiàn)了交替糖蔗糖酶的高效表達。以蔗糖為供體，以其他小分子糖為受體，利用重組工程菌生產的交替糖蔗糖酶催化合成交替糖。本方法實現(xiàn)了交替糖蔗糖酶的高效表達，展現(xiàn)良好的工業(yè)應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及一種交替糖蔗糖酶表達及其制備交替糖的方法，屬于酶工程技術領域。

背景技術

交替糖蔗糖酶具有α-轉糖苷活性，可以以蔗糖為底物生產交替糖。交替糖(alternan)包括交替糖多糖(polyalternan)和交替糖寡糖(oligoalternan)，含有交替連接的α-1,6糖苷鍵與α-1,3糖苷鍵。交替糖多糖是一種新型的胞外多糖，平均分子量Mr在1×10⁶-1×10⁷Da，聚合度DP在1×10⁴以上。交替糖寡糖是一種新型功能性低聚糖，平均分子量Mr在540-1800Da，聚合度DP在3-10。交替糖因其獨特結構所賦予的特殊的性能，使其具有多種生理功能及加工特性。尤其是其獨特的低熱值、抗酶解、抗微生物降解、耐酸、耐熱特性，使其在醫(yī)藥、化妝品、飼料、保健、食品和印刷工業(yè)以及化妝品工業(yè)具有巨大的應用前景。但是，交替糖在自然界中的含量較少，交替糖主要是通過發(fā)酵制備和酶法制備獲取。

雖然國內外已經(jīng)對交替糖蔗糖酶的來源、性質、生化特性、作用機理等方面的研究，并取得了一定的研究成果，但是總的來說，所獲得的交替糖蔗糖酶在純度和比活方面依然比較低，不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產的要求。目前，交替糖生產菌株發(fā)酵生產交替糖的產量和轉化率均比較低，現(xiàn)有文獻報道構建表達的交替糖蔗糖酶酶活為3.9U/mL，嚴重制約了交替糖的大規(guī)模工業(yè)化制備，限制了交替糖的廣泛應用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的第一個目的是提供一種基因，如SEQ?ID?NO.2所示序列。

本發(fā)明第二個目的是提供一種高效異源表達交替糖蔗糖酶的重組畢赤酵母，其含有SEQ?ID?NO.2所示序列。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組畢赤酵母是以畢赤酵母(Pichiapastoris)X33為宿主，以pPICZα為表達載體。

本發(fā)明第三個目的是提供含有所述基因如SEQ?ID?NO.2所示的重組畢赤酵母的構建方法。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述SEQ?ID?NO.2所示的基因是Leuconostoccitreum?NRRL?B-1355來源的交替糖蔗糖酶經(jīng)密碼子優(yōu)化獲得的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，將SEQ?ID?NO.2所示基因序列插入到表達載體pPICZα的酶切位點EcoRⅠ和NotⅠ之間，獲得表達載體pPICZα-ASR。

在本發(fā)明的一種實施方式中，用限制性內切酶SacⅠ線性化重組表達載體pPICZα-ASR，電轉到畢赤酵母(Pichiapastoris)X33中，并涂布在含有50～600ug/mL?zeocin的YPD固體培養(yǎng)基上28-30℃培養(yǎng)約24-48h。篩選正確的轉化子，經(jīng)搖瓶發(fā)酵篩選獲得重組酶活性高的菌株，為Pichiapastoris?X33/pPICZα-ASR。

本發(fā)明第四個目的在于提供利用上述重組畢赤酵母生產交替糖蔗糖酶的方法，采用甲醇誘導策略發(fā)酵生產交替糖蔗糖酶。

在本發(fā)明的一種實施方式中，從培養(yǎng)有重組畢赤酵母的平板上挑取單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)24h作為種子液。

在本發(fā)明的一種實施方式中，將獲得的種子液以8～20％(v/v)的接種量接種于3L發(fā)酵罐中，裝液量30-60％(v/v)的發(fā)酵培養(yǎng)基中。