[發明專利]結核分枝桿菌sRNA實時熒光定量PCR標準品及其應用

在審

• 申請號: 202110084221.1
• 申請日: 2021-01-21
• 公開（公告）號: CN112725484A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 付英梅;張鳳民;李婷;顧偉;宋武琦;范云帆
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

本發明公開了一種結核分枝桿菌sRNA實時熒光定量PCR標準品及其應用。為了更準確的檢測樣本中的結核分枝桿菌sRNAMTS2823的表達水平，本發明設計了RNA標準品序列，并建立了相應的定量檢測體系。本發明中的RNA標準品繪制的RT?qPCR標準曲線具有較高的擴增效率和良好的線性關系，可對生物樣本中的sRNAMTS2823序列進行絕對值定量，可用于檢測樣本中的結核分枝桿菌sRNAMTS2823的表達水平。

技術領域

本發明涉及結核分枝桿菌一種sRNA標準品的設計、制備和在實時定量檢測中的應用。屬于微生物學領域，

背景技術

細菌的小RNA(small RNA，sRNA)是在菌體中表達量較高、能形成二級結構、具有穩定性的一類小分子非編碼RNA。結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是結核病的病原體。2019年，全球估計有1000萬人患結核病，140萬人因結核病死亡[Globaltuberculosis report 2020.Geneva:World Health Organization.Licence:CC BY-NC-SA3.0IGO,2020.]。MTB是細胞內寄生菌，在宿主體內生長緩慢，其致病機制仍不甚清晰。受機體免疫水平和抗癆藥物的影響，不同的MTB感染者細菌增殖狀態和排菌量有很大差異，導致結核病的病原學分離陽性率很低。在感染組織中，受機體免疫作用或抗結核藥物的影響，結核分枝桿菌的sRNA出現差異表達，參與感染與免疫的進程。所以，對MTB sRNA表達量的準確測定，有利于進一步深入研究sRNA在MTB致病中的作用、探索MTB sRNA作為特異性診斷標志物的價值。MTS2823為體外培養的MTB指數增長期時含量最豐富的一種sRNA，在小鼠感染的肺組織中，MTS2823也是表達水平較高的一類sRNA[KB,A.,et al.,Sequence-basedanalysis uncovers an abundance of non-coding RNA in the total transcriptomeof Mycobacterium tuberculosis.PLoS pathogens,2011.7(11):p.e1002342.DV,I.,etal.,Expression ofMycobacterium tuberculosis small RNAs in mice models oftuberculosis.Bioorganicheskaiakhimiia,2014.40(2):p.253-6.]。

近年來，在病原微生物核酸的檢測中，實時熒光定量PCR技術應用廣泛。逆轉錄(reverse transcription，RT)和實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)為定量檢測樣品中的RNA提供了技術手段。定量PCR中常用的標準品來自基因組DNA或者質粒DNA片段，經制定工作標準曲線后，可實現對樣本中DNA的準確定量。目前，研究者定量檢測樣品中的RNA表達水平時，也使用這類標準品。但是，樣本中RNA的定量檢測，采用的方法為逆轉錄-定量PCR法(RT-qPCR)，即先經過逆轉錄過程將RNA轉化為cDNA后，方可進一步通過qPCR的方法對其中的靶cDNA進行檢測。逆轉錄的效率通常在30-40％左右，并且具有很高的可變性，不同RNA拷貝被逆轉錄成cDNA的效率不同[A.,et al.,Properties ofthe reverse transcription reaction in mRNA quantification.Clinical chemistry,2004.50(3):p.509-15.Miranda,J.A.and G.F.Steward,Variables influencing theefficiency and interpretation of reverse transcription quantitative PCR(RT-qPCR):An empirical study using Bacteriophage MS2.JVirol Methods,2017.241:p.1-10.]?；贒NA標準品所制定的工作標準曲線，定量的為逆轉錄后靶cDNA的拷貝數，而受逆轉錄效率的影響，用于反映樣本中的RNA拷貝數時會發生很大偏差，常導致測定值遠低于樣品中的實際RNA拷貝數。