[發明專利]利用超高分辨成像技術實時追蹤活體植物細胞核內蛋白運動的方法

在審

• 申請號: 202110082155.4
• 申請日: 2021-01-21
• 公開（公告）號: CN112760340A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 崔亞寧;錢虹萍
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/20;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

1.利用超高分辨成像技術實時追蹤活體植物細胞核內蛋白運動的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)轉基因植物材料的獲得：利用基因工程手段，將目的基因和熒光報告基因進行融合表達，構建到植物基因組上，篩選得到轉基因植株；

2)超分辨成像觀察：用超分辨激光共聚焦顯微鏡對所得的轉基因植株樣品進行成像觀察；

3)拍攝時間序列圖像：利用超分辨激光共聚焦顯微鏡拍攝時間序列圖像，捕獲和追蹤活細胞核內蛋白的動態，以獲得高時空的單分子運動信息；

4)圖像處理和分析運動參數信息：根據超分辨激光共聚焦顯微鏡所成像的時間序列圖像信息，使用軟件對采集的多張序列圖像進行分析和處理，并繪制熒光蛋白在植物細胞核內的運動軌跡，并進一步計算出目標蛋白的熒光強度隨時間的變化規律，進而得到熒光強度動態分布的動力學參數信息；

其中，所述植物為擬南芥。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)包括：通過同源重組方法將目的基因和帶有熒光報告基因GFP的真核表達載體進行連接，其中目的基因位于熒光報告基因ATG起始密碼子的上游；所得重組表達載體通過農桿菌介導法轉化擬南芥，篩選得到轉基因植株。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的基因為擬南芥MED18基因，所述真核表達載體為pCAMBIA2300-35S-GFP。

4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述樣品為轉基因擬南芥的根部樣品，優選根尖。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中用ZeissLSM880Airyscan超分辨激光共聚焦顯微鏡的Airyscan模式進行成像，物鏡使用100倍油鏡，選取激發波長為488nm，收集波長為500～560nm，對樣品進行超分辨成像，并根據擬南芥的樣品狀態和熒光亮度，來調整激光強度和EMGain電子增益倍數，使成像效果達到最佳。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟3)中利用超分辨激光共聚焦顯微鏡拍攝的時間序列圖像，Frame Size設置為512×512，拍攝速度設置為Max 9倍速，以632ms的時間間隔獲取圖像。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟4)中根據超分辨激光共聚焦顯微鏡所成像的時間序列圖像信息，使用Image J軟件對采集的多張序列圖像進行分析和處理，利用Imaris軟件對目標蛋白的運動進行追蹤和分析，數據擬合在OriginPro8軟件中完成。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟4)中將大于3幀的熒光點用于細胞核內熒光蛋白的分析。