[發明專利]液質聯用結合超濾法測定美羅培南或亞胺培南的血漿蛋白結合率

在審

• 申請號: 202110077970.1
• 申請日: 2021-01-20
• 公開（公告）號: CN112684075A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 王晨;張現化;楊平;翟所迪;許明哲;趙榮生;楊麗;張斗勝;崇小萌;王立新;姚尚辰;王欣
• 申請（專利權）人: 北京大學第三醫院（北京大學第三臨床醫學院）;中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供液質聯用結合超濾法測定美羅培南或亞胺培南的血漿蛋白結合率，本方法將液相色譜串聯質譜檢測技術與超濾法相結合，分別測定血漿中美羅培南或亞胺培南的總濃度，以及超濾液中藥物的游離濃度。在處理樣本時加入了MOPs穩定劑，解決了藥物穩定性差的問題，進而使測定結果更加準確。本發明可快速、高通量測定藥物的蛋白結合率，尤其適用于不穩定的藥物分子。

技術領域

本發明涉及藥物分析領域，具體地說，涉及液質聯用結合超濾法測定美羅培南或亞胺培南的血漿蛋白結合率的方法。

背景技術

美羅培南(MEM)和亞胺培南(IMP)為碳青霉烯類抗生素，它們的化學結構不穩定。現有檢測美羅培南游離濃度的方法中，由于沒有解決藥物的不穩定問題，導致測定結果不準確。

發明內容

本發明的目的是提供液質聯用結合超濾法測定美羅培南或亞胺培南的血漿蛋白結合率。

為了實現本發明目的，本發明提供一種液質聯用結合超濾法測定美羅培南或亞胺培南的血漿蛋白結合率的方法，包括：

1)取空白血漿，加入MOPs緩沖液，再加入不同濃度的藥物溶液，配制成不同濃度的含藥血漿樣本；再向其中加入內標溶液，渦旋混勻后加入乙腈(乙腈用以沉淀蛋白)，渦旋混勻后離心，取上清液加入乙腈混勻，用于HPLC-MS/MS檢測；以美羅培南或亞胺培南峰面積與內標峰面積之比為縱坐標，美羅培南或亞胺培南的濃度為橫坐標，進行回歸分析，建立針對血漿中藥物總濃度的標準曲線①；

2)取空白血漿，加入MOPs緩沖液，將體系轉移至超濾管中，于15-30℃6000～10000g離心20-30min，收集空白超濾液；向空白超濾液中加入不同濃度的藥物溶液，配制成不同濃度的含藥超濾液樣本；再向其中加入內標溶液，渦旋混勻后加入乙腈(乙腈用以沉淀蛋白)，渦旋混勻后離心，取上清液加入乙腈混勻，用于HPLC-MS/MS檢測；以美羅培南或亞胺培南峰面積與內標峰面積之比為縱坐標，美羅培南或亞胺培南的濃度為橫坐標，進行回歸分析，建立針對血漿中游離藥物濃度的標準曲線②；

3)將步驟1)中的空白血漿替換成待測血漿，將待測血漿分成A、B兩等份，血漿A用于測定血漿中藥物總濃度，血漿B用于測定血漿中游離藥物濃度；

4)取血漿A，加入MOPs緩沖液混合，加入內標溶液，渦旋混勻后加入乙腈，渦旋混勻后離心，取上清液加入乙腈混勻，進行HPLC-MS/MS檢測，測定待測血漿中美羅培南或亞胺培南的峰面積，代入上述標準曲線①，得到待測血漿的藥物總濃度；

5)取血漿B，加入MOPs緩沖液混合，將體系轉移到超濾管中，于15-30℃6000～10000g離心20-30min，收集超濾液；向超濾液中加入內標溶液，渦旋混勻后加入乙腈，渦旋混勻后離心，取上清液加入乙腈混勻，進行HPLC-MS/MS檢測，測定待測血漿的超濾液中美羅培南或亞胺培南的峰面積，代入上述標準曲線②，得到待測血漿的游離藥物濃度；按照式I)計算出待測血漿中美羅培南或亞胺培南的血漿蛋白結合率：

血漿蛋白結合率＝(藥物總濃度-游離藥物濃度)/藥物總濃度×100％ 式I)

其中，步驟1)和2)中所述的空白血漿是指來自同一個體、不含美羅培南或亞胺培南的血漿；

所述MOPs緩沖液的配制方法如下：將3-(N-嗎啉)丙磺酸半鈉鹽2g，溶于10ml水中。

所述內標溶液為MEM-d6溶液。

前述的方法，步驟1)和2)中以MOPs液為試劑，分別配制濃度為10、20、40、100、200、400、1000μg·mL^-1的美羅培南或亞胺培南標準曲線工作液。

所述內標溶液是用MOPs液配制的MEM-d6濃度為50μg·mL^-1的內標溶液。