[發(fā)明專利]一種高比活性重組人促卵泡激素的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110077967.X
• 申請(qǐng)日: 2021-01-20
• 公開（公告）號(hào): CN112679601A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹玉鋒;常東英;陳子楊;張健鋒;劉國瑞;賈媛;李錚;遲祥;孟多佳;唐劍光;王金敏;常軍亮;韓慧利;李利;張雪梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長春生物制品研究所有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C07K14/59
• 分類號(hào): C07K14/59;C12P21/02;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及促卵泡激素的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高比活性重組人促卵泡激素的制備方法,包括以下步驟：（1）取rhFSH/CHO?S工作庫細(xì)胞株接種于裝有CD Forti CHO培養(yǎng)基（含8mM谷氨酰胺）的搖瓶中進(jìn)行復(fù)蘇，振搖培養(yǎng)2?4天，待活細(xì)胞濃度達(dá)到2?3×106/ml，活度不低于80%時(shí)，按2?4×105/ml的密度轉(zhuǎn)接下一級(jí)搖瓶，按同樣方法逐級(jí)放大完成種子液制備；（2）將上述所述種子液按活細(xì)胞4?6×105/ml的密度接種生物反應(yīng)器，溶氧為30?60%，轉(zhuǎn)速為180?220rpm(7L生物反應(yīng)器)、100?140rpm(14L生物反應(yīng)器)，基礎(chǔ)通氣速率為0.001?0.01vvm，分別于接種后第4、6、8、10天按2?5%比例（V/V）流加CellTurbo Feed2補(bǔ)料培養(yǎng)基。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及促卵泡激素的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高比活性重組人促卵泡激素的制備方法。

背景技術(shù)

促卵泡激素（Follicle-Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）是一種由腦垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的糖蛋白類促性腺激素，是調(diào)控哺乳動(dòng)物生長、性成熟和繁殖的核心激素。FSH在治療排卵障礙、促使卵泡正常生長、成熟和性腺甾體類固醇的產(chǎn)生、激活和保持正常精子的數(shù)目和質(zhì)量、體外受精和胚胎移植助孕技術(shù)上有重要意義。

目前商品化的FSH制劑主要有尿源FSH（uFSH）和重組人促卵泡素（rhFSH），其中rhFSH多以CHO細(xì)胞為表達(dá)宿主，以外分泌形式進(jìn)行表達(dá)，具有與天然FSH相似的糖基化構(gòu)型，產(chǎn)品具有比活性高，質(zhì)量可控及易于產(chǎn)業(yè)化的優(yōu)勢(shì)。FSH結(jié)構(gòu)復(fù)雜含α和β兩個(gè)亞基，分別含5對(duì)和6對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵，并各含2個(gè)N糖糖基化位點(diǎn)。糖類是FSH不可或缺的重要組分，分布于糖鏈末端的唾液酸可直接影響其活性、代謝及半衰期等，糖基化側(cè)鏈數(shù)目及唾液酸含量對(duì)FSH的生物活性和半衰期具有重要作用，而產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)決定了更加嚴(yán)苛的細(xì)胞培養(yǎng)和純化工藝。基于傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方式，具有潛在的動(dòng)物源性安全性風(fēng)險(xiǎn)，批間差大，成本高，且不利于產(chǎn)業(yè)化等弊端。近年來發(fā)展起來的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無血清全懸浮培養(yǎng)工藝采用了無血清培養(yǎng)基尤其是化學(xué)成分限定培養(yǎng)基（Chemical DefinedMedia, CDM），具有成分明確，無動(dòng)物源成份，安全性高，易于放大等優(yōu)勢(shì)。此外，如何從培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中高效獲得高純度、高比活性的rhFSH也是制約本品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵性技術(shù)難題。

目前上市的FSH制劑根據(jù)其來源及制備工藝主要分為以下兩類：第一類是從絕經(jīng)后婦女的尿中提取出來的尿源FSH（uFSH），但此種促卵泡激素含有其它人源蛋白的污染，批間糖基結(jié)構(gòu)存在差異，尿源需求量巨大，無法滿足快速增長的市場需求。另一類是以CHO細(xì)胞為代表的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組人促卵泡素（rhFSH），rhFSH不僅以外分泌形式表達(dá)，且具有與天然FSH相似的翻譯后糖基化修飾特性，能產(chǎn)生高生物活性的FSH，因此，該類FSH具有安全性高、比活性好、質(zhì)量可控且易于產(chǎn)業(yè)化的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)方式具有批間差異大、安全性風(fēng)險(xiǎn)高，且只能貼壁培養(yǎng)不易于放大等劣勢(shì)。相比傳統(tǒng)的含血清貼壁培養(yǎng)工藝，無血清全懸浮培養(yǎng)工藝具有下述優(yōu)勢(shì)：（1）克服了血清批次間差異，使細(xì)胞培養(yǎng)更加穩(wěn)定；（2）去除血清、胰酶等動(dòng)物源性成分，降低由其帶來的病毒或支原體等動(dòng)物源性污染；（3）CDM培養(yǎng)基不含蛋白等大分子，不含蛋白水解物等混合物，利于下游純化設(shè)計(jì)；（4）培養(yǎng)基成分明確，有利于對(duì)細(xì)胞的生長、代謝、基因調(diào)控等方面進(jìn)行研究。無血清懸浮懸浮培養(yǎng)技術(shù)因其易于在生物反應(yīng)器培養(yǎng)，自動(dòng)化程度高，便于在線或離線觀察細(xì)胞數(shù)量、狀態(tài)，工藝簡單可控易于放大；無需傳統(tǒng)貼壁細(xì)胞胰酶消化等步驟，操作環(huán)節(jié)少，污染率低，進(jìn)而使得產(chǎn)品更安全、質(zhì)量更穩(wěn)定。此外，純化工藝也成為工業(yè)生產(chǎn)的限速步驟，如何從細(xì)胞培養(yǎng)液中高效獲得rhFSH純品，并保證其結(jié)構(gòu)正確、比活性高是另一關(guān)鍵性技術(shù)難題。目前rhFSH純化工藝中多含有金屬螯合或染料親和層析步驟，但基于金屬螯合親和層析工藝對(duì)目標(biāo)蛋白活性具有潛在的不良影響，而染料親和層析則存在親和特異性差等問題。