[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)的外泌體的制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110077720.8
• 申請(qǐng)日: 2021-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112903999A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江暢;金海振;朱雪茹;夏武艷;余佳樺;高翔;傅小龍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院）;上海市胸科醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/569
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/569;G01N15/14
• 代理公司: 北京沃知思真知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11942
• 代理人: 王茜

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)的外泌體的制備方法，屬于細(xì)胞物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，包括如下步驟：(1)取外泌體樣品；(2)對(duì)外泌體樣品進(jìn)行冰上解凍處理；(3)對(duì)外泌體樣品超聲處理；(4)向離心管內(nèi)加入PBS，然后再向該離心管中加入抗體，充分混勻后再加入外泌體樣品，再經(jīng)過(guò)孵育、超高速離心機(jī)離心處理后得PBS重懸外泌體。本發(fā)明公開(kāi)了一種用于納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)的外泌體的制備方法，本方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確、可靠，靈敏度高，無(wú)需經(jīng)有機(jī)溶劑浸提，對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的選擇性高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)的外泌體的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)工作原理是在細(xì)胞分子水平上通過(guò)單克隆抗體對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析。流式細(xì)胞術(shù)一般包括熒光抗體孵育，離心重懸，上機(jī)檢測(cè)三個(gè)主要步驟。外泌體是指包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)，細(xì)胞自主分泌的小膜泡(30-150nm)，現(xiàn)其特指直徑在40-100nm的盤(pán)狀囊泡，攜帶上述信息在細(xì)胞通訊中發(fā)揮作用。近年來(lái)外泌體在腫瘤研究領(lǐng)域顯現(xiàn)出重要地位，檢測(cè)來(lái)源于患者血漿的外泌體也是液體活檢的手段之一。但外泌體顆粒大小(100nm)并不是細(xì)胞流式儀(500nm)的最佳監(jiān)測(cè)范圍，納米流式儀(Flow NanoAnalyzer)應(yīng)運(yùn)而生。納米流式檢測(cè)儀覆蓋了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀200nm以下粒徑檢測(cè)的盲區(qū)，其可實(shí)現(xiàn)單個(gè)納米顆粒(7-1000nm)的粒徑及其分布、顆粒濃度、以及生物化學(xué)性狀的高靈敏、高選擇性、高通量檢測(cè)。由于外泌體提取需要在很高的離心力下提取，細(xì)胞流式術(shù)的離心和孵育方案不適用于外泌體。

現(xiàn)在還沒(méi)有出現(xiàn)使用納米流式儀表征外泌體新生抗原的專(zhuān)利。由于納米流式儀和超高速離心機(jī)是高端實(shí)驗(yàn)設(shè)備，滿足該實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室較少，因此開(kāi)展此類(lèi)實(shí)驗(yàn)較為困難?，F(xiàn)有使用普通細(xì)胞流式儀器使用納米流式儀標(biāo)記外泌體新生抗原的技術(shù)難點(diǎn)主要在僅為300nm的外泌體受限于檢測(cè)儀器精度其尚未出現(xiàn)對(duì)外泌體未知蛋白的間接標(biāo)記技術(shù)。但外泌體新生抗原是熱門(mén)的領(lǐng)域，針對(duì)于外泌體新生抗原的檢測(cè)鑒定一直是一個(gè)難題。現(xiàn)基于一些免疫吸附法成本高，推廣困難，而間接標(biāo)記流式技術(shù)是基于普通流式技術(shù)的提升，其應(yīng)用的機(jī)會(huì)更多。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)的外泌體的制備方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種用于納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)的外泌體的制備方法，包括如下步驟：

(1)取外泌體樣品；

(2)對(duì)外泌體樣品進(jìn)行冰上解凍處理；

(3)對(duì)外泌體樣品超聲處理；

(4)向離心管內(nèi)加入PBS，然后再向該離心管中加入抗體，充分混勻后再加入外泌體樣品，再經(jīng)過(guò)孵育、超高速離心機(jī)離心處理后得PBS重懸外泌體。

進(jìn)一步的，步驟(3)中所述的超聲處理時(shí)控制超聲的時(shí)長(zhǎng)為10min。

進(jìn)一步的，步驟(4)中所述的離心管的容量為200ul；所述的PBS的加入量為48ul；所述的抗體的加入量為1ul；所述的外泌體樣品的加入量為1ul。

進(jìn)一步的，步驟(4)中所述的孵育的時(shí)長(zhǎng)控制為30min。

進(jìn)一步的，步驟(4)中所述的超高速離心機(jī)離心處理時(shí)的時(shí)長(zhǎng)為20min，離心力控制為100000g。

一種用于納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)的外泌體的應(yīng)用，具體是在外泌體新生抗原驗(yàn)證上的應(yīng)用。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)的外泌體的制備方法，本方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確、可靠，靈敏度高，無(wú)需經(jīng)有機(jī)溶劑浸提，對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的選擇性高，極具推廣應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明