[發(fā)明專利]固定化重組大腸桿菌將L-纈氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮纈氨酸的方法

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• 申請日: 2021-01-20
• 公開（公告）號: CN112680485A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳靜;代靜新;宋偉;周怡雯;陳修來;高聰;劉佳
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12P7/50
• 分類號: C12P7/50;C12N11/084;C12N11/10;C12N11/14;C12N11/04;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

1.一種固定化重組大腸桿菌用于將L-纈氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮纈氨酸的方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌是能夠表達(dá)L-氨基酸脫氨酶的基因工程菌，將重組大腸桿菌包埋在納米四氧化三鐵-聚乙烯醇-海藻酸鈉復(fù)合載體中，將固定化細(xì)胞用于L-纈氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮纈氨酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)細(xì)胞懸液的制備：將重組大腸桿菌制成菌懸液；

(2)微生物細(xì)胞的固定化：取納米四氧化三鐵，在超聲波的協(xié)助下使其溶于水中，之后取聚乙烯醇和海藻酸鈉，并加入到納米四氧化三鐵水溶液中，加熱使聚乙烯醇和海藻酸鈉溶解，納米四氧化三鐵、水、聚乙烯醇和海藻酸鈉的混合物中，聚乙烯醇和海藻酸鈉的最終濃度分別為2-4％和6-10％，納米四氧化三鐵的濃度是0.1g/L；

將所得到的混合物滅菌，并加入菌懸液，使得混合液的OD₆₀₀＝8，混勻后，將混合液滴加到含有2％氯化鈣的飽和硼酸溶液中，靜置4-12h，過濾收集得到固定化菌體，并清洗固定化菌體3-4次；

(3)固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-纈氨酸：混合固定化菌體、反應(yīng)液和底物L(fēng)-纈氨酸，進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還對固定化細(xì)胞進行重復(fù)利用性：在某一批次的反應(yīng)結(jié)束后，從反應(yīng)液中回收固定化菌體，經(jīng)過清洗后，將固定化菌體再次投入新一批次的反應(yīng)；每一批次轉(zhuǎn)化反應(yīng)進行20-32h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌是E.coli BL21(pET-28a-PmLAAD)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化菌體的直徑為2.5-4.5mm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中反應(yīng)液的組成為NaCl 8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的固定化菌體的濃度為50-150g/L反應(yīng)液，底物L(fēng)-纈氨酸的濃度為65-100g/L。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的時間為24h，反應(yīng)溫度是35℃，轉(zhuǎn)速200rpm，pH＝8.5。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(3)中底物的濃度是100g/L。

10.應(yīng)用權(quán)利要求1-9任一項所述的方法得到固定化重組大腸桿菌。