[發明專利]一種熒光標記CRISPR/SpCas9系統介導的基因替換體系及其在植物中的應用

在審

• 申請號: 202110072099.6
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN112680474A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 夏蘭琴;李慧園;閆磊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/65
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張羽

本發明公開了一種重組載體、DNA分子、應用及植物中以RNA轉錄本為模板進行目的基因同源重組的方法。該重組載體包括表達盒甲、表達盒乙和表達盒丙；表達盒甲包括啟動子甲、SpCas9?T2A?GFP和終止子；表達盒乙包括啟動子乙和gRNA的編碼基因，gRNA靶向的目標片段是植物基因組中將被替換的DNA片段；表達盒丙包括啟動子丙、核酸酶甲的編碼基因、模板區段、核酸酶乙的編碼基因，模板區段包括目標片段的上游同源臂、供體片段和目標片段的下游同源臂；供體片段與目標片段具有如下差異：供體片段含有預期在目標片段中引入的差異核苷酸。本發明的重載載體利用CRISPR/SpCas9系統，以RNA作為同源重組修復模板，在水稻中實現目的基因的替換，擴展TT?HDR對于CRISPR/SpCas9系統的應用范圍。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種重組載體、DNA分子、應用及植物中以RNA轉錄本為模板進行目的基因同源重組的方法。

背景技術

CRISPR/SpCas9系統自2013年8月首次報道對植物基因組進行編輯以來，大量相關研究相繼開展。這些研究分別以擬南芥、生煙、水稻和小麥等植物為供試材料，通過轉基因技術將優化的SpCas9基因和gRNA轉入植物體內，SpCas9蛋白通過自身的核酸內切酶活性，對任何緊隨PAM(NGG)的20bp的靶點序列進行編輯，從而引起靶位點基因組DNA序列雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)，然后通過非同源末端連接(non-homologous endjoining，NHEJ)或同源重組介導的修復(homology-directed repair，HDR)兩種方式引入突變，從而實現了植物基因組的定點編輯，證明該技術在植物生物學研究領域具有極高的應用價值。盡管CRISPR/SpCas9作為一種新的靶向基因修飾技術，在農作物改良中得到廣泛應用，但目前主要局限于基因隨機突變和敲除。農作物地方品種或近緣屬種中，含有大量優異農藝性狀基因，和常規栽培品種相比，這些基因只存在單個堿基或者多個堿基差異(SNPs)。通過常規雜交和回交轉育方法，引入這些基因或優異性狀，需要多年多代材料選育，費時費力。

HDR修復途徑不同于NHEJ，通常需要DNA修復模板的參與，且修復更為準確。根據HDR途徑的修復特點，已將發展成為一種有效的基因組編輯工具：對靶基因進行定點修飾或定點插入外源基因，從而改良生物性狀。但由于HDR在植物細胞中固有頻率較低，供體修復模板的可用性不足，主要的修復途徑仍然是非同源末端連接(NHEJ)。2016年，Svitashev等人通過使用單鏈寡核苷酸或雙鏈DNA載體作為修復模板，通過CRISPR/SpCas9介導的基因編輯，將ALS基因中165位的的絲氨酸變為脯氨酸，從而賦予了玉米植物氯磺隆等除草劑抗性。ALS基因編碼關鍵支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸生物合成的關鍵酶，是氯磺隆和雙嘧苯甲酸鈉(BS)等重要除草劑的主要靶標基因。該基因發生敲除后植株很難存活，并且在轉化過程中可以在培養基中添加BS用于輔助篩選。鑒于ALS基因的特殊性，目前在作物中，其它目的基因的精準替換仍然是一個具有挑戰性的課題。

此外，基因組編輯技術介導的植物基因定點編輯和修飾能直接對目標性狀基因進行改良，在編輯植株后代，去除CRISPR/SpCas9表達元件非常重要。因為攜帶CRISPR/SpCas9元件的植物屬于轉基因植物，既增加了脫靶的風險，又不利于后續的功能分析。后代通過自然分離或與野生型雜交獲得無轉基因植株，但鑒定過程存在工作量大且易污染等問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何快速和/或有效的鑒定非轉基因的編輯植株。

為解決上述技術問題，本發明提供了一種用于取代植物基因組中的目標片段的重組載體，包括如下表達盒甲、表達盒乙和表達盒丙。

所述表達盒甲自5’端至3’端依次可包括如下原件：啟動子甲、SpCas9-T2A-GFP融合基因和終止子。所述SpCas9和GFP通過T2A串聯共表達，所述T2A是能發生自我切割的小肽。