[發明專利]同步檢測多種馬鈴薯病毒的試紙條及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110070926.8
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN112557656B
• 公開（公告）日: 2023-09-05
• 發明（設計）人: 劉衛平;李志新;張微;趙雪;張金鵬;付春江;張新宇;張瑩瑩
• 申請（專利權）人: 黑龍江省農業科學院克山分院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 王曉麗

1.一種同步檢測多種馬鈴薯病毒的試紙條，包括樣品墊（1）、金標墊（2）、NC膜（3）、檢測線T1線（5）、T2線（6）、T3線（7）、T4線（8）、T5線（9）、T6?線（10）、質控線C線（11）、吸水墊（4）和PVC底板（12），所述PVC底板（12）的上部貼合有NC膜（3），所述NC膜（3）上部兩端分別搭接有金標墊（2）和吸水墊（4），所述金標墊（2）上部搭接有樣品墊（1），所述檢測線T1線（5）、T2線（6）、T3線（7）、T4線（8）、T5線（9）、T6線（10）依次設置在靠近樣品墊（1）的NC膜（3）表面上，且檢測線T1線（5）距離樣品墊（1）最近，檢測線T6線（10）距離樣品墊（1）最遠，所述質控線C線（11）設置在靠近吸水墊（4）的NC膜（3）上，其特征在于：

所述檢測線T1線（5）包被有PLRV兔多克隆抗體,所述PLRV兔多克隆抗體劃膜濃度為0.5-1.1μL/cm,所述用來進行劃膜的PLRV兔多克隆抗體溶液濃度為1.8-2.5mg/mL；

所述檢測線T2線（6）包被有PVA兔多克隆抗體,所述PVA兔多克隆抗體劃膜濃度為0.5-1.1μL/cm,所述用來進行劃膜的PVA兔多克隆抗體溶液濃度為1.5-2.0mg/mL；

所述檢測線T3線（7）包被有PVM羊多克隆抗體,所述PVM羊多克隆抗體劃膜濃度為0.5-1.1μL/cm,所述用來進行劃膜的PVM羊多克隆抗體溶液濃度為0.5-1.5mg/mL；

所述檢測線T4線（8）包被有PVS羊多克隆抗體,所述PVS羊多克隆抗體劃膜濃度為0.5-1.1μL/cm,所述用來進行劃膜的PVS羊多克隆抗體溶液濃度為0.5-1.5mg/mL；

所述檢測線T5線（9）包被有PVY兔多克隆抗體,所述PVY兔多克隆抗體劃膜濃度為0.6-1.0μL/cm,所述用來進行劃膜的PVY兔多克隆抗體溶液濃度為0.5-1.5mg/mL；

所述檢測線T6線（10）包被有PVX兔多克隆抗體,所述PVX兔多克隆抗體劃膜濃度為0.6-1.0μL/cm，所述用來進行劃膜的PVX兔多克隆抗體溶液濃度為0.5-1.5mg/mL；

所述質控線C線（11）上包被有馬鈴薯病毒羊抗兔抗體；所述包被在質控線C線（11）上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液劃膜濃度為0.5-1.2μL/cm，所述用來進行劃膜的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液的濃度為0.8-1.5mg/mL；

所述金標墊（2）上結合有馬鈴薯病毒膠體金標記物混合物；所述馬鈴薯病毒膠體金標記物混合物為PVA膠體金標記物、PVM膠體金標記物、PVS膠體金標記物、PVX膠體金標記物、PVY膠體金標記物和PLRV膠體金標記物的混合物；所述馬鈴薯病毒膠體金標記物混合物溶液的噴涂濃度為4-6μL/cm；

同步檢測多種馬鈴薯病毒的試紙條的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：金標墊（2）的制備；

步驟2：NC膜（3）的制備；步驟3：

樣品墊（1）的制備；

步驟4：試紙條的組裝；

所述步驟1：金標墊（2）的制備,包括如下步驟：

1)馬鈴薯病毒膠體金標記物的制備：

復溶液配方：PH8.0-8.8，8-12%蔗糖，3-6%海藻糖，0.5-2%牛血清白蛋白，溶劑為0.1-0.2mol/L的Tris-HCL溶液；

膠體金溶液的制備：取297-300?mL超純水于圓底燒瓶中，加入2-4?mL濃度為1-2%氯金酸溶液，混勻；將圓底燒瓶置于恒溫器中，加入干凈攪拌子，低速攪拌并加熱沸騰；一次性加入2-4mL1-2%檸檬酸三鈉溶液，繼續煮沸；觀察溶液顏色變化，由淺黃色→黑色→紫色→紫紅色，當變為酒紅色時，繼續煮沸20-30min，補充超純水至原體積，停止加熱，冷卻至室溫；超純水做空白對照，掃描膠體金溶液在500-550nm?之間的吸收值，吸收峰值在515-525nm出現，則制備的膠體金溶液合格；

馬鈴薯病毒膠體金標記物制備工藝：取1支離心管，標記為K1，加入1-2ml膠體金溶液，然后加入4-6μL?PVX兔多克隆抗體、4-6μLPVY兔多克隆抗體、4-6μLPVS羊多克隆抗體、4-6μLPVM羊多克隆抗體，再加入1.5-3μL0.1mol/L的K₂CO_3，，混勻后靜置25-35min；另取2支離心管，標記為K2和K3，分別加入1-2ml膠體金溶液，K2中加入4-6μLPLRV兔多克隆抗體和0.5-1.5μL0.2mol/L的K₂CO₃，K3中加入4-6μLPVA兔多克隆抗體和0.5-1.5μL0.2mol/L的K₂CO₃，混勻后震蕩25-35min；向K1、K2和K3中分別加入80-120μL封閉劑，靜置25-35min,在9000-12000rpm，4℃條件下，離心45-55min，棄上清，向K1、K2和K3分別加入80-120μL封閉劑，在9000-12000rpm，4℃條件下，離心25-35min，分別棄上清，向K1中加入80-120μL復溶液懸浮沉淀，懸浮好后將K1中的懸浮液轉入到K2中，在K2中懸浮沉淀，最后將K2中的懸浮液轉入K3中，在K3中懸浮沉淀，隨后將K3在400-600rpm，4℃條件下離心10-20min，吸取上清液，上清液就是馬鈴薯病毒膠體金標記物，保存備用；

金標墊（2）與馬鈴薯病毒膠體金標記物的結合：選用玻璃纖維膜作為金標墊（2）的支撐材料，將制備好的馬鈴薯病毒膠體金標記物，用三維大平臺噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂馬鈴薯病毒膠體金標記物的最佳噴涂濃度為4-6μL/cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃?干燥箱中，干燥時間1.5-2.5h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃熱合封口，保存備用。