[發明專利]一種表達藻膠裂解酶的載體與工程菌

在審

• 申請號: 202110070870.6
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN112680470A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 秦真東;林蠡;李鳳麟;湯穎;魏麗香;劉春;寇紅巖
• 申請（專利權）人: 仲愷農業工程學院
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/60;C12N1/19;C12N9/88;A23L29/00;C12R1/84
• 代理公司: 杭州創智卓英知識產權代理事務所(普通合伙) 33324
• 代理人: 唐超文

本發明公開了一種表達藻膠裂解酶的載體以及重組工程菌，該重組工程菌為能表達高酶活力的藻膠裂解酶酵母菌菌株，其分泌的藻膠裂解酶可用于制備海藻寡糖。本發明還提供了上述重組工程菌的最適發酵溫度和最適發酵pH值，可以更進一步提高藻膠裂解酶的產量，在工業上具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，涉及一種表達藻膠裂解酶的載體與工程菌。

背景技術

海藻膠是一種L-古羅糖醛酸和D-甘露糖醛酸的線性陰離子聚合物。但由于海藻膠具有膳食纖維特性，難以被機體吸收利用，從而限制了他的應用范圍。藻膠裂解酶(Alginate Lyase)已經被證明可催化海藻膠生成低聚糖，且海藻酸鹽低聚糖作為添加劑廣泛應用于食品、藥品以及農業中。

海藻膠可以通過物理方法和化學方法來制備海藻寡糖。酶解法由于具有專一性，可控性較強的特點而被廣泛研究。藻膠裂解酶作為裂解海藻膠的工具酶，探索其酶切的最適溫度、最適pH值并獲得高酶活力的酶至關重要。

發明內容

本發明第一個方面的目的在于，提供一種能高表達高活力藻膠裂解酶的工程菌菌株。

本發明所采取的技術方案是：通過博來霉素和營養缺陷條件同時篩選出能穩定表達藻膠裂解酶的工程菌。連續傳代后，采用DNS方法從上述工程菌中篩選能表達高活力藻膠裂解酶的工程菌。

本發明的第一個方面，提供一種載體，所述載體中插入有藻膠裂解酶的表達序列。

優選地，所述藻膠裂解酶的表達序列如SEQ ID NO.3所示。

進一步地，根據本發明第一個方面所述的載體，所述載體上還含有標簽的表達序列。

優選地，所述標簽為His標簽。

在本發明的部分實施例中，所選用的標簽為His標簽。

進一步地，根據本發明第一個方面所述的載體，所述載體上還含有抗生素抗性基因的序列。

優選地，所述抗生素抗性基因為博來霉素抗性基因。

在本發明的部分實施例中，所選用的抗生素抗性基因為博來霉素抗性基因。

在本發明的部分實施例中，所述載體選用pPICZαA質粒，載體的構建方法具體方法為：通過序列合成，構建p PICZαA-AL重組質粒。

本發明的第二個方面，提供一種重組工程菌，所述工程菌中包含本發明第一個方面所述的載體。

優選地，所述重組工程菌為大腸桿菌、酵母菌。

在本發明的部分實施例中，所述重組工程菌為大腸桿菌，具體的構建方法為：將pPICZαA-AL重組質粒轉化大腸桿菌，次日挑取平板上的大腸桿菌單菌落于含博來霉素的培養基中培養，并同時對菌液進行PCR檢測，選取陽性菌落。

更具體地，所述培養基為LB培養基；所述培養的條件為：約37℃，約200rpm/min；所述培養的儀器為恒溫搖床。

在本發明的部分實施例中，所述重組工程菌為酵母菌，具體的構建方法為：提取pPICZαA-AL重組質粒；將pPICZαA-AL重組質粒轉化GS115酵母菌，利用含有博來霉素的YPD培養基篩選陽性菌株。