[發(fā)明專利]鑒別熊本牡蠣的特征序列、特異性鑒定引物及鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110068402.5
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN112626238B
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉圣;薛清剛;徐洪強(qiáng);柳敏海;林志華
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江萬里學(xué)院寧海海洋生物種業(yè)研究院;浙江萬里學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 謝瀟

1.鑒別熊本牡蠣的特異性鑒定引物，其特征在于，該特異性鑒定引物的序列為：

上游引物MNR-F：5'-CTGTAAGTATATTTGTCTTCCA-3'；

下游特異性引物MNR-S-R：5'-AGGCTTTCACTCCACTTACT-3'。

2.鑒別熊本牡蠣的鑒定方法，其特征在于，基于線粒體非編碼區(qū)對熊本牡蠣進(jìn)行特異性鑒定，具體包括以下步驟：

（1）將采集到的熊本牡蠣解剖后，對閉殼肌組織取樣，液氮速凍后低溫冰箱保存；

（2）使用試劑盒進(jìn)行熊本牡蠣基因組DNA提取，得到DNA原液，質(zhì)檢合格后將DNA原液稀釋至1-10ng/μL，作為PCR模板備用；

（3）設(shè)計(jì)上游引物MNR-F和下游特異性引物MNR-S-R作為物種鑒定的特異性鑒定引物，其中，上游引物MNR-F為5'-CTGTAAGTATATTTGTCTTCCA-3'，下游特異性引物MNR-S-R為5'-AGGCTTTCACTCCACTTACT-3'；

（4）以步驟（2）中提取得到的熊本牡蠣基因組DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到目的片段的PCR產(chǎn)物；

（5）將PCR產(chǎn)物在220V、200mA條件下進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，得到大小660±5bp的產(chǎn)物條帶，即為熊本牡蠣的特征序列SEQ ID NO.1，該特征序列位于牡蠣的甘氨酸t(yī)RNA合成酶和脯氨酸t(yī)RNA合成酶之間的線粒體非編碼區(qū)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別熊本牡蠣的鑒定方法，其特征在于，步驟（4）中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘；再進(jìn)行30個循環(huán)：94°C、30 秒，50°C、30秒，72°C、50秒；最后72°C延伸10分鐘。