[發明專利]一株產他克莫司生長快速菌株及應用

有效

• 申請號: 202110063583.2
• 申請日: 2021-01-18
• 公開（公告）號: CN112852635B
• 公開（公告）日: 2022-10-25
• 發明（設計）人: 柳志強;方晨捷;張博;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/20;C12N15/01;C12P17/18;C12R1/465
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及一株通過UV?ARTP誘變方法篩選到的生長周期明顯縮短的筑波鏈霉菌及其應用。所述菌株為筑波鏈霉菌ZJBN2001(Streptomyces tsukubensisZJBN2001)，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2020年12月10日，保藏編號CCTCC NO：M 2020883，保藏地址為中國武漢，武漢大學，郵編430072。本發明的有益效果主要體現在：(1)本發明通過UV?ARTP誘變的方法得到了一株生長周期明顯縮短的菌株；(2)采用本發明方法誘變育種獲得的筑波鏈霉菌ZJBN2001，相對原始菌株S1，他克莫司產量提高了100％，能夠作為基因工程菌的原始菌株。(3)通過本發明方法可以得到發酵周期顯著縮短的菌株，對于工業生產有著巨大的意義。

(一)技術領域

本發明涉及誘變篩選高產他克莫司筑波鏈霉菌的方法，以及一株通過UV-ARTP 復合誘變篩選得到的產他克莫司的生長快速筑波鏈霉菌及其應用。

(二)背景技術

當前，隨著人們生活水平的逐步提高，一些不健康的生活習慣慢慢催生著身體器官的病變。全世界每年因肝病、腎病需要器官移植的患者不斷增加。而在器官移植的過程中可能會出現急性排斥反應和全身感染，合理地運用免疫抑制劑治療能很大程度地減少移植失敗的幾率。現在主要在臨床上使用的有環孢素A和他克莫司等免疫抑制劑，其中他克莫司對比環孢素A其效果更好且副反應更少。

1984年，日本藤澤制藥株式會社(現為安斯泰來制藥集團)研究所從分離自日本筑波山土壤的筑波鏈霉菌發酵液中首次提取到一種大環內酯類抗生素。該菌株名為Streptomyces tsukubaensis No.9993，目前被稱為S.tsukubaensis NRRL 18488，是大多數用于他克莫司工業生產的菌株的親本菌株。這種新發現的抗生素成為首個具有大環內酯結構的免疫抑制劑，其最初被命名為FR900506或FK506，隨后被命名為藤霉素 (Fujimycin)和如今廣泛使用的名稱他克莫司(Tacrolimus)。經過大量的臨床試驗，他克莫司于1994年由藤澤制藥公司在日本上市，同年在美國和德國也開始商業化生產。如今，他克莫司被廣泛用作腎，肝和心臟移植的免疫抑制劑，還可用于治療炎癥性皮膚病。此外，由于其神經保護和神經再生活性，它還具有其他臨床治療潛力。

他克莫司是一種23元大環內酯類抗生素，同時是一類高效的免疫抑制劑，兼具抗真菌活性和T細胞增殖抑制能力。他克莫司的免疫抑制活性主要是因其對T細胞增殖的抑制作用，他克莫司進入細胞后首先與細胞溶質受體(如FKBP12)相互作用，其復合物(FKBP12-FK506)能夠抑制鈣調神經磷酸酶的鈣調蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性，從而導致鈣調神經磷酸酶不再能使轉錄因子去磷酸化。而去磷酸化的轉錄因子是控制T細胞增殖所必需的。

當前全世界范圍內由于肝病、腎病等原因需要移植器官的患者數量逐年增加。中國每年需要器官移植的患者人數大概約有30萬人。廣闊的市場前景使研究他克莫司提產具有巨大的醫學意義和經濟價值。他克莫司的化學結構復雜，目前多采用微生物發酵法生產，因此篩選優秀的他克莫司生產菌株是一項至關重要的工作。而傳統育種是提高菌株次級代謝產物產量的切實有效的方法，其中誘變育種因成本低廉、操作簡便被廣泛運用于生產菌株的構建。

(三)發明內容

本發明是一株通過UV-ARTP誘變方法篩選到的生長周期明顯縮短的筑波鏈霉菌誘變株及應用。

本發明采用的技術方法是：

一種誘變篩選高產他克莫司筑波鏈霉菌的方法，所述方法包括：

(1)將待測筑波鏈霉菌接種至GYM平板26～30℃培養5～7天，取顏色為紅色或白色的孢子洗脫至生理鹽水中，將洗下的孢子懸液過濾、離心后去除上清液，加入生理鹽水重懸后，離心、重新洗脫一次，用生理鹽水重懸作為孢子懸液；